楊永昌， 趙美萍， 謝武韜， 高玲玲， 郭艷瓊， 趙莉藺*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801； 2中國科學(xué)院動物研究所，農(nóng)業(yè)蟲鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，北京100101； 3山西大學(xué)附屬中學(xué)，山西 太原030006；4澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)部，澳大利亞 珀斯6913

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus（Steiner &Buhrer） Nickle 是世界農(nóng)林重大害蟲之一，是松樹萎焉?。╬ine wilt disease， PWD）的主要致病因子（Mamiya，1983）。 松材線蟲傳播到歐亞國家后便迅速蔓延，大面積危害松林（Wingfield et al.，1982，1984），現(xiàn)已成為40 多個國家的植物檢疫對象（Dwinell，1997； Rautapaa，1986； Smith，1985）。

目前，對睡眠機制的研究主要集中于秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans（Raizen et al.，2008）。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲的靜息行為符合判斷睡眠的標(biāo)準(zhǔn)：擁有靜息行為、覺醒閾值增高、特定的姿勢、睡眠剝奪促進入睡、由分子時鐘調(diào)控的片段化睡眠等（Nelson & Raizen，2013）。 秀麗隱桿線蟲的靜息行為分為兩類：發(fā)育階段睡眠（developmental sleep， DTS）和壓力誘導(dǎo)睡眠（stress-induced sleep，SIS）（Trojanowski & Raizen，2016）。 其中，引起細(xì)胞應(yīng)激的環(huán)境因素也可以促進SIS，包括熱應(yīng)激、感染、饑餓、毒性物質(zhì)等（Los et al.，2013； Jones &Candido，1999； Raizen et al.，2008； You et al.，2008），其睡眠歷期也取決于環(huán)境因素作用的強度（Hill et al.，2014）。 秀麗隱桿線蟲在應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激壓力時，除采取dauer 滯育轉(zhuǎn)型措施外，SIS 對線蟲適應(yīng)應(yīng)激壓力也很重要（Fry et al.，2016）。 類似的，松材線蟲遇到長期的干燥、低溫、食物缺乏、種群密度增大等不利環(huán)境條件時，會形成LⅢ滯育蟲態(tài)（趙莉藺，2007），在突然施加的短期環(huán)境壓力下，可以觀察到松材線蟲采取了另一種“假死”策略，而此現(xiàn)象研究甚少。

蛔甙（ascarosides）是一類重要的信息素（Von et al.，2012），可誘導(dǎo)dauer 形成并影響線蟲聚集、交配等其他復(fù)雜行為。 研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲處于饑餓和繁殖交配期等不同狀態(tài)時分泌的蛔甙的種類、濃度和不同種類蛔甙比例有很大區(qū)別（Kaplan et al.，2011； Park et al.，2012）。 Butcher et al.（2007）研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲在不同溫度下分泌蛔甙的濃度不同并可誘導(dǎo)不同的行為反應(yīng)。 蛔甙在秀麗隱桿線蟲中研究較多。

葡萄糖、海藻糖、山梨糖醇和甘油等小分子抗凍物質(zhì)常被線蟲用來作為抗寒保護劑，其中海藻糖是最重要的一類（Ash et al.，1986； Grewal et al.，2002）。 然而，迄今為止，有關(guān)蛔甙在松材線蟲中的功能作用僅有與松墨天牛Monochamus alternatusHope 互作的少量報道（Zhao et al.，2014， 2016）。溫度作為生態(tài)環(huán)境的重要組成因子，深刻影響松材線蟲的生態(tài)分布，其世代時間隨著適溫區(qū)溫度的下降而延長（Zhao et al.，2007）。 線蟲采取耐凍型和避凍型2 種耐寒策略應(yīng)對低溫脅迫作用，如馬鈴薯腐爛線蟲Ditylenchus destructor以幼蟲形式在土壤中越冬（林茂松，1999）、海藻糖等低分子量抗凍保護物質(zhì)在線蟲體內(nèi)聚集（Ash et al.，1986； Grewal et al.，2002）。 本研究探討了低溫環(huán)境應(yīng)激壓力下，松材線蟲的靜息行為、糖醇含量變化和線蟲蛔甙分泌種類及含量的變化，研究了不同種類、濃度的蛔甙對松材線蟲靜息行為的作用，以期為進一步闡明松材線蟲種內(nèi)互作的化學(xué)與分子機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試松材線蟲來源與培養(yǎng)方法

供試松材線蟲均取自浙江省富陽市的疫木，通過貝爾曼漏斗法（Baermann，1917）分離線蟲，并在中國科學(xué)院動物研究所農(nóng)業(yè)蟲鼠害綜合治理研究國家重點實驗室使用常規(guī)馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基接種灰葡萄孢菌Botrytis cinerea 并進一步擴大培養(yǎng)。

同步化繁殖型線蟲樣品制備：待灰葡萄孢菌長滿90 mm PDA 培養(yǎng)基時，接入混合齡松材線蟲，置于25 ℃黑暗條件培養(yǎng)4～5 d。 采用15 mL 磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution，PBST）沖洗PDA 培養(yǎng)基2～3 遍，制得混合齡松材線蟲懸液，并收集于90 mm 玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)靜置4 ～6 h。 待松材線蟲蟲卵粘附在培養(yǎng)皿上，將含松材線蟲的懸浮液丟棄，并用PBST 緩沖液溫和沖洗2 ～3 次，取適量PBST 緩沖液于培養(yǎng)皿內(nèi)，以水位不超過3 mm 為宜。 24 h 后，3000 r·min-1離心2 min 即得到同步化2 齡幼蟲（L2）。 分別將同步化L2幼蟲置于灰葡萄孢PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)1、2、3 d，采用貝爾曼漏斗法收集并離心即得到同步化3 齡幼蟲（L3）、4 齡幼蟲（L4）和成蟲。

1.2 線蟲分泌粗提物的制備

使用50 mL 錐形瓶大麥培養(yǎng)基接種灰葡萄孢菌，待菌生長17 d 后，接種松材線蟲懸液200 μL，25 ℃人工氣候箱培養(yǎng)8 ～10 d，此時大量線蟲轉(zhuǎn)移到錐形瓶壁上。 用30 mL 蒸餾水將線蟲沖出后，將洗脫液收集到15 mL 離心管中， 室溫13300 r·min-1離心15 min，收集上清液于新15 mL 離心管中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至蒸干，加入1 mL 乙醇重溶，室溫13300 r·min-1離心15 min，收集上清液于0.22 μm 針式過濾器（millipore）過濾后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 低溫脅迫處理

PBST 緩沖液清洗同步化L2、L3、L4和成蟲3～4遍后，分別取各齡期線蟲100 頭置于含3 mL PBST緩沖液的培養(yǎng)皿中（直徑35 mm），并放到4 ℃人工氣候箱中，作為處理組；取相同處理的各齡期線蟲放到25 ℃人工氣候箱中，作為對照組。 每組10 次重復(fù)。 處理48 h 后置于體視顯微鏡下觀察計數(shù)，DP72 攝像拍照記錄。

1.4 松材線蟲糖及多元醇含量測定

樣品制備：采用蔗糖懸浮法將接種灰葡萄孢菌的PDA 培養(yǎng)基中沖出的松材線蟲與其他雜質(zhì)分離后（Freckman et al.，1975），混勻，分為3 份，其中1份用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后稱線蟲干重，其余2 份分別作為低溫脅迫處理和對照，每組設(shè)置5 個重復(fù)。 處理48 h 后，3000 r·min-1離心1 min 收集線蟲于2 mL 離心管中，自動研磨儀破碎90 s，加入色譜純甲醇700 μL 后， 充 分 震 蕩30 s， 加 入80 μL 2 mg·mL-1核糖醇內(nèi)標(biāo)后充分震蕩60 s，70 ℃水浴20 min 后，11000 r·min-1離心15 min；取上清150 μL 置于1.5 mL 離心管中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入40 μL methoxyamination reagent （20 mg·mL-1，Sigma-Aldrich），37 ℃、120 r·min-1搖床震蕩3 h，再加入70 μL 三氟乙酰胺，37 ℃、120 r·min-1搖床震蕩1.5 h，待樣品充分衍生化后，加入300 μL ddH2O， 500 μL 色譜純異辛烷，充分震蕩后離心，取上清液用無水硫酸鈉過濾后置于樣品瓶中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

上機檢測：使用氣相色譜質(zhì)譜（GC： Aglient 6890N， MSD： 5973）進行定性定量。 具體色譜條件：載氣為氦氣，流速設(shè)置為1 mL·min-1；色譜柱（型號HP-5，60 m×0.25 mm，0.25 μm）自動進樣，進樣量1 μL，無分流進樣，進樣口溫度230 ℃。 升溫程序為：70 ℃保持5 min，5 ℃·min-1升溫至310℃，保持12 min，快速降溫至70 ℃后保持5 min。

1.5 松材線蟲蛔甙含量測定

樣品制備：與1.4 中類似，采用蔗糖懸浮法清洗線蟲后，混勻，分為3 份，其中1 份用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后稱線蟲干重，其余2 份分別作為低溫脅迫處理和對照（以ddH2O 替代PBST 緩沖液）。 處理48 h后，3000 r·min-1離心2 min，收集上清液于1.5 mL離心管中，棄線蟲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，加入700 μL色譜純乙醇重溶，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

上機檢測：樣品先經(jīng)ZORBAX_SB-Aq 液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）分離后，進入LTQ Orbitrap 系統(tǒng)分析。 樣品在色譜柱上的洗脫梯度是8%～100%甲醇（另一相為2%甲醇、0.1%甲酸）洗脫15 min，洗脫速度為250 μL·min-1。 質(zhì)譜參數(shù)：一級質(zhì)譜Orbitrap 掃描范圍是90 ～400 m·z-1，一級質(zhì)譜里選取141、155、153、169、197、195 m·z-1進行二級質(zhì)譜LTQ-CID 碰撞模式，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量50%，活化q 值0.25，活化時間10 ms。

1.6 生物測定

在25 ℃條件下，以700 μL 1% 瓊脂（agar）為載體，將粗提物、蛔甙C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9涂抹于agar 載體表面，超凈臺吹干后加入約50 頭松材線蟲成蟲，同時以蒸餾水涂抹1% agar 作對照?；走癈5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9 濃度分別為100、10、1 nmol·L-1，10 pmol·L-1、10 fmol·L-1和10 amol·L-1。 每組設(shè)3 個重復(fù)。 蛔甙處理18 h 后置于體視顯微鏡下計數(shù)，并用DP72 拍照記錄。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用Turkey 多重比較法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對松材線蟲靜息率的影響

通過對低溫條件下不同齡期的松材線蟲的靜息率比較，結(jié)果顯示，與25 ℃對照相比，4 ℃條件下，L2、L3、L4和成蟲的靜息率大幅提升，具體表現(xiàn)為活動減少、進食停止、形態(tài)上呈C 型、對刺激的反應(yīng)降低等。 其中，L3對低溫最為敏感，低溫處理后的靜息率最高，達(dá)到73.70%，而L2和成蟲對低溫的敏感度較L3低，分別為53.43%和55.80%；但是，成蟲在25 ℃條件下幾乎不表現(xiàn)出靜息狀態(tài)，因此與對照組相比，成蟲的靜息表型差異最大，為對照的30.09 倍，而L2、L3、L4在常溫條件下仍有少量靜息蟲態(tài)，所以與對照差異較小，分別為對照的5.29、5.67、8.73 倍（圖1）。

2.2 低溫對松材線蟲體內(nèi)糖、醇含量的影響

如圖2 所示，低溫脅迫處理能誘導(dǎo)松材線蟲中海藻糖合成，其海藻糖含量顯著高于25 ℃常溫處理組，約為對照的2.32 倍；而山梨糖醇、葡萄糖和甘油含量與對照均無明顯差異。

圖1 低溫對松材線蟲靜息率的影響Fig.1 Effects of low temperature on fraction quiescence of pinewood nematode

圖2 低溫對松材線蟲糖、醇含量的影響Fig.2 Effects of low temperature on free sugars and polyols of pinewood nematode

2.3 低溫對松材線蟲蛔甙分泌的影響

通過測定6 種蛔甙（C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9）在常溫下（25 ℃）的分泌模式及在4 ℃低溫條件下分泌量的變化。 結(jié)果顯示，C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9 中，C5 含量最高，濃度達(dá)到371.14 nmol·L-1·mg-1，C6、 C7 和ΔC6 含 量 次 之， 為77.21、16.45、8.10 nmol·L-1·mg-1，ΔC9 分泌的最少，僅為0.31 nmol·L-1·mg-1，C9 常溫下幾乎不分泌；低溫條件下，除C9 外，其余蛔甙的含量均大幅下降，其中，C5 和C6 分別為對照的4.36% 和15.30%。 值得注意的是，ΔC6、C7 和ΔC9 在低溫脅迫條件下停止分泌或者分泌含量低于儀器檢測限，幾乎檢測不到；而C9 在低溫下開始分泌，可能與松材線蟲在低溫條件下的滯育有關(guān)（圖3）。

2.4 粗提物對松材線蟲靜息率的影響

如圖4 所示，粗提物處理后，松材線蟲的靜息率在6～9 h 內(nèi)較對照迅速升高，在9 h 時靜息率最高，約為100%；之后在9 ～12 h 中靜息率維持在100%左右；約3 h 之后，靜息率逐漸下降，在27 h時，達(dá)到最低值，僅為1.10%。 為了探究粗提物對從靜息狀態(tài)恢復(fù)的線蟲的影響，我們?nèi)?7 h 時一部分的恢復(fù)線蟲再次進行粗提物處理，結(jié)果顯示，其靜息率在1 h 內(nèi)提升到最大值，但僅為初次粗提物處理的一半，達(dá)到了50.15%。 之后，進入穩(wěn)定時期，松材線蟲靜息率隨時間變化比較穩(wěn)定。 本實驗也做了未加松材線蟲的灰葡萄孢菌大麥培養(yǎng)基的粗提物對松材線蟲靜息率的影響，結(jié)果顯示，其靜息率維持在一個極低的水平。

圖3 低溫對松材線蟲蛔甙含量的影響Fig.3 Effects of low temperature on ascarosides of pinewood nematode

圖4 粗提物對靜息率的影響Fig.4 Effects of crude extracts on fraction quiescence of pinewood nematode

2.5 蛔甙對松材線蟲靜息率的影響

蛔甙靜息率曲線（圖5）表明：松材線蟲對不同濃度的蛔甙靜息表現(xiàn)不同。 結(jié)果顯示，線蟲對C6、C9 和ΔC9 的感受隨著濃度變化具有基本相同的模式，隨著蛔甙濃度降低，松材線蟲的靜息率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢：在10 nmol·L-1濃度時靜息率達(dá)到最高點，其中，C6 和C9 效果較明顯，靜息率為47.36%和49.93%。 而C7 則呈現(xiàn)為另一種模式，隨著C7 濃度降低，松材線蟲靜息率持續(xù)升高：在10 fmol·L-1濃度時達(dá)到最大值61.08%。

圖5 蛔甙對松材線蟲靜息率的影響Fig.5 Effects of ascarosides on fraction quiescence of pinewood nematode

3 討論與結(jié)論

本研究表明，L2、L3和L4在常溫條件下存在一定數(shù)量的靜息蟲態(tài)，這可能與一些線蟲正處于齡期末的脫皮階段（Raizen et al.，2008）即DTS 靜息狀態(tài)有關(guān)，使松材線蟲幼蟲的靜息率存在一定的本底水平，與此相對地，成蟲在25 ℃時幾乎不存在靜息蟲態(tài)。 研究表明，低溫脅迫作為一類應(yīng)激條件可以誘導(dǎo)較多數(shù)量松材線蟲進入SIS 靜息狀態(tài)；而糖醇測定結(jié)果則表明，松材線蟲通過增加海藻糖等抗凍物質(zhì)合成的策略來降低過冷卻點，增強其耐寒性。

此外，本研究表明，松材線蟲分泌粗提物中存在誘導(dǎo)線蟲進入靜息狀態(tài)的信息物質(zhì)。 低溫處理后，松材線蟲開始分泌C9，表明C9 可能在誘導(dǎo)松材線蟲進入靜息狀態(tài)或在低溫條件下誘導(dǎo)其他蛔甙含量變化起著關(guān)鍵作用；其他5 種蛔甙（C5、C6、ΔC6、C7和ΔC9）的含量均大幅下調(diào)，其中C7 和ΔC9 停止分泌，可能在誘導(dǎo)靜息信號傳導(dǎo)中起重要作用。 而蛔甙靜息實驗證明，C6、C7、C9 和ΔC9 為靜息誘導(dǎo)信號分子，松材線蟲對C5、C6、C9 和ΔC9 的感受具有基本相同的模式，在較高濃度作用較為明顯； C7 在高濃度時誘導(dǎo)作用也較明顯，但是在較低濃度時與之相反，松材線蟲靜息率反而有增高的趨勢。 值得注意的是，任意單一一種蛔甙都無法解釋低溫下蛔甙種類及濃度變化對SIS 的誘導(dǎo)現(xiàn)象，由此可見，可能C5、C6、C7 和C9 與C7 共同參與了對松材線蟲耐寒性的調(diào)控，C7 與其他種類蛔甙在靜息調(diào)控方面是一種拮抗關(guān)系，而C7 在其中起主導(dǎo)作用，在低溫脅迫作用后，C5、C6、C7 和C9 含量大幅下調(diào)，解除了對C7 的抑制作用。 結(jié)果C7 濃度雖然同樣下降，但其他蛔甙的抑制解除反而使松材線蟲進入SIS，表現(xiàn)出對低溫的適應(yīng)。 因此，有待進一步闡明蛔甙對松材線蟲壓力誘導(dǎo)睡眠行為的作用，并揭示其內(nèi)在分子機制。