許佳丹， 王書平， 蔣費(fèi)濤， 朱雅君， 葉 軍， 李 飛

1上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海201708； 2浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所，浙江 杭州310058； 3重慶三峽學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，重慶404000

瓜實(shí)蠅Bactrocera cucurbitae（Coquillett） 俗稱針蜂，幼蟲稱瓜蛆，其寄主廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，可危害120 多種蔬菜和水果（Christenson & Foote，1960），嚴(yán)重影響蔬菜瓜果的品質(zhì)和產(chǎn)量（Nishida & Bess，1950）。 世界上很多國(guó)家和地區(qū)都將瓜實(shí)蠅列為重要的檢疫性有害生物。 為了有效地控制檢疫性實(shí)蠅的危害及傳播，自2000 年起，國(guó)家質(zhì)檢總局在全國(guó)范圍內(nèi)開展實(shí)蠅監(jiān)測(cè)工作，對(duì)防控檢疫性實(shí)蠅的傳播、蔓延起到了重要作用，也為開展檢疫性實(shí)蠅的不同地理種群遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了寶貴材料。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR）具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性、易檢測(cè)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此被開發(fā)成為分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于親子鑒定、遺傳圖譜和基因組結(jié)構(gòu)分析等方面（Jones et al.，2010）。 SSR 標(biāo)記可應(yīng)用于昆蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)與分化、不同生物型的鑒別、天敵昆蟲的鑒定、種群間親緣關(guān)系的鑒定等方面（何恒果，2008）。 隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為目前研究昆蟲系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳變異分化以及外部形態(tài)特征難以區(qū)分的近緣種鑒定等的方法之一（Badouin et al.，2013）。 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 分子標(biāo)記包含的遺傳信息更豐富，可以提高遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確性。 羅梅等（2014）基于扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsisTinsley 的研究表明，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 標(biāo)記是可行的，可應(yīng)用于物種的遺傳多樣性分析。 李梅梅等（2018）利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的SSR 序列在粘蟲Mythimna separata（Walker）的7 個(gè)不同地理種群中成功篩選到7 個(gè)具有多態(tài)性且能穩(wěn)定擴(kuò)增的SSR 位點(diǎn)。 Pascoal & Kilner（2017）利用基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出14 對(duì)SSR多態(tài)性引物并進(jìn)行遺傳多樣性研究。

通過(guò)對(duì)瓜實(shí)蠅的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選SSR 序列，收集了國(guó)內(nèi)11 個(gè)地區(qū)的口岸瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)種群，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及遺傳多樣性分析，為探索我國(guó)瓜實(shí)蠅的口岸監(jiān)測(cè)工作提供理論依據(jù)和實(shí)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的瓜實(shí)蠅雌成蟲，分別來(lái)自廣州（113°E，23°N）海關(guān)植檢實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)的瓜實(shí)蠅、上海寶山地區(qū)（121°E，31°N）監(jiān)測(cè)到的瓜實(shí)蠅種群。 其他轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），包括來(lái)自美國(guó)夏威夷（SRX689016）、中國(guó)臺(tái)灣（SRX1041320）的瓜實(shí)蠅種群。

用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本分別來(lái)自上海、浙江、江蘇、廣西、海南、新疆、云南、四川、天津、北京、廣東等11 個(gè)地區(qū)，共49 個(gè)監(jiān)測(cè)樣本（表1）。

表1 瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本收集信息Table 1 Geographic origin of B. cucurbitae samples

1.2 總RNA 的提取與檢驗(yàn)

按照Trizol Reagent 方法提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的完整性，經(jīng)Nanodrop 2000 分光光度計(jì)（IMPLEN，CA，USA）測(cè)定RNA 的純度，依據(jù)Qubit RNA Assay Kit 使用說(shuō)明定量測(cè)定RNA 濃度，并用Agilent 2100（Agilent Technologies，CA，USA）精確檢測(cè)RNA 的完整性。

1.3 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

RNA 樣品檢測(cè)合格后，在帶有Oligo （dT）的磁珠富集mRNA 中加入fragmentation buffer，將mRNA打斷成短片段，以mRNA 為模板構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。 文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit 2.0、Agilent 2100 和Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。 最后使用Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序由上海美吉生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.4 轉(zhuǎn)錄組組裝

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)處理去接頭、poly-N 和低質(zhì)量序列后獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（clean data）。 在此基礎(chǔ)上計(jì)算GC 含量（堿基G 和C 的數(shù)量總和占總體堿基數(shù)的百分比）、Q20（質(zhì)量值≥20 的堿基占總堿基的百分比）、Q30（質(zhì)量值≥30 的堿基占總堿基的百分比）和重復(fù)序列水平，再應(yīng)用Trinity 軟件對(duì)高質(zhì)量的clean data 進(jìn)行拼接、過(guò)濾和組裝，最終獲得高質(zhì)量的unigene。

1.5 轉(zhuǎn)錄組SSR 的篩選

利用SciRoKo 3.4 軟件（默認(rèn)參數(shù)）獲取瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組中的SSR 位點(diǎn)信息（Kofler et al.，2007），根據(jù)重復(fù)單元堿基個(gè)數(shù)將SSR 定義為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、 五核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)SSR。 用Excel 軟件對(duì)不同地理種群瓜實(shí)蠅的SSR 信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 DNA 提取、引物篩選設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增

采用DNeasy Blood & Tissue 試劑盒（QIAGEN）提取單頭瓜實(shí)蠅成蟲基因組DNA。 利用Primer 5.0對(duì)篩選出來(lái)的SSR 序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（Untergasser et al.，2012），篩選出15 對(duì)多態(tài)性高的SSR 引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表2），引物篩選以重復(fù)性好、具多態(tài)性、擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定為依據(jù)。 所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 PCR 反應(yīng)體系為20 μL：Premix Taq （Takara） 10 μL，上下游引物各1 μL， DNA 模板1 μL，加ddH2O 至20 μL。 PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃保存?zhèn)溆谩?取8 μL PCR 產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在凝膠成像系統(tǒng)下拍照保存。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

對(duì)聚丙烯酰胺凝膠圖譜上每對(duì)應(yīng)物的擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，在相同的遷移率位置上，有帶賦值為1，無(wú)帶賦值為0，形成[0，1]數(shù)據(jù)矩陣。 先采用NTedit 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的輸入和保存，再使用NTsys 軟件和Popgene 32 （Nei，1978； Yeh & Boyle，1997）軟件統(tǒng)計(jì)分析基因分化系數(shù)、群體總基因的多樣性和群體內(nèi)基因多樣性、基因流及遺傳相似系數(shù)及遺傳距離，以非加權(quán)類平均法（unweighted class average method，UPGMA） 進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

表2 具有多態(tài)性的瓜實(shí)蠅SSR 引物信息Table 2 SSR primers with polymorphism of B. cucurbitae

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)普通PCR 及Agilent 2100 分析儀對(duì)提取的瓜實(shí)蠅總RNA 質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)檢評(píng)估。 結(jié)果表明，RNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)的上機(jī)測(cè)序（圖1、2、3）。

2.2 瓜實(shí)蠅雌成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量

采用Illumina 二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)瓜實(shí)蠅（3 個(gè)重復(fù)）的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序。 所有樣本GC 含量均介于38.88%～42.31%；每個(gè)樣本Q20 均大于94%，Q30均大于91%，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確度較高，可以用于后續(xù)分析；利用Trinity 軟件進(jìn)行組裝，得到序列總長(zhǎng)度分別 為29462159、20646356、44400736、46515243 bp，片段平均長(zhǎng)度分別為151、126、101、100 bp，平均GC 含量分別為42%、41%、40%、39%（表3）。

2.3 瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)及重復(fù)類型分析

從表4、表5 可知，廣州實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、上海地區(qū)監(jiān)測(cè)、中國(guó)臺(tái)灣和美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)分別為16415、25972、16277 和22719 個(gè)，SSR 的出現(xiàn)頻率（SSR 數(shù)目與總unigenes 的數(shù)目比值）分別為27.40%、35.05%、27.04%、36.84%。 從出現(xiàn)頻率來(lái)看，美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)最豐富，其次為上海、廣州和臺(tái)灣種群。

圖1 廣州實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群總RNA 檢測(cè)Fig.1 Agilent 2100 electrophoresis of total RNA of the B. cucurbitae populations from Guangzhou lab

圖2 上海地區(qū)監(jiān)測(cè)種群總RNA 檢測(cè)Fig.2 Agilent 2100 electrophoresis of total RNA of the B.cucurbitae populations from Shanghai

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.3 B. cucurbitae total RNA samples on agarose gel electrophoresis

表3 瓜實(shí)蠅不同地理種群轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary of sequencing data of different geographical populations of B. cucurbitae

不同地理種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組中SSR 的主要重復(fù)類型為三核苷酸重復(fù)，廣州、上海、臺(tái)灣和美國(guó)種群瓜實(shí)蠅的三核苷酸重復(fù)類型的SSR 數(shù)量分別占各自總SSR 數(shù)量的41.23%、32.90%、34.58%、38.12%；其次為四核苷酸重復(fù)類型，占各自總SSR數(shù)量的21.57%、20.64%、22.94%、22.92%；對(duì)廣州、臺(tái)灣和美國(guó)種群而言，第三豐富的SSR 重復(fù)類型為二核苷酸重復(fù)類型，占各自總SSR 數(shù)量的11.93%、10.82%、13.67%，而上海種群占比第三的是單核苷酸重復(fù)類型，為17.23%。 總體上六核苷酸重復(fù)類型占比最少，上海、臺(tái)灣和美國(guó)種群瓜實(shí)蠅的六核苷酸重復(fù)類型的SSR 數(shù)量分別占各自總SSR 數(shù)量的7.47%、8.50%、8.06%，廣州種群的單核苷酸重復(fù)類型占比最少，僅占其總SSR 數(shù)量的7.48%。

廣州、上海、臺(tái)灣和美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的不同重復(fù)類型SSR 中，單核苷酸重復(fù)類型的平均長(zhǎng)度最大，分別為22.82、30.58、23.75 和23.82 bp；五核苷酸重復(fù)類型的平均長(zhǎng)度最小，分別為17.97、18.55、17.78 和18.79 bp。 廣州、上海和臺(tái)灣種群瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)中，單核苷酸重復(fù)類型的平均錯(cuò)配數(shù)最大，分別為0.56、0.62、0.57，美國(guó)種群瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點(diǎn)中雙核苷酸重復(fù)類型的平均錯(cuò)配數(shù)最大，為0.52。 平均錯(cuò)配數(shù)最小的是五核苷酸重復(fù)，分別為0.14、0.18、0.12、0.21。

廣州、上海、臺(tái)灣和美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的不同重復(fù)類型SSR 中，平均距離最長(zhǎng)的是三核苷酸重復(fù)類型，分別為112.43、107.32、100.12、106.35 kb；上海、臺(tái)灣和美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的不同重復(fù)類型SSR 中平均距離最短的是六核苷酸重復(fù)類型，分別為24.37、22.32、24.8 kb，對(duì)于廣州種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR 而言，平均距離最短的是單核苷酸重復(fù)類型，僅為20.4 kb。

廣州、上海、臺(tái)灣和美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布最多的是5 次重復(fù)，分別占總SSR 數(shù)量的25.96%、20.48%、24.16%、22.07%，最少的為13、14 次重復(fù)。 廣州種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR 中特有的重復(fù)類型為五核苷酸15 次重復(fù)、六核苷酸14 次重復(fù)。 美國(guó)種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR 中特有的重復(fù)類型為六核苷酸13 次重復(fù)。

表4 不同地理種群瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組中SSR 的基本信息Table 4 SSRs information in transcriptomes of different geographical populations of B. cucurbitae

2.4 瓜實(shí)蠅不同地理種群監(jiān)測(cè)樣本間的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NTsys 軟件對(duì)PCR 電泳結(jié)果（圖4）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析，結(jié)果（表6）顯示，遺傳一致度在0.17～1.00之間，說(shuō)明瓜實(shí)蠅不同地理種群監(jiān)測(cè)樣本間存在遺傳分化，可能具有不同的來(lái)源背景。 從圖5 可以看出新疆種群分布于A 組，四川種群分布于C 組，浙江種群分布于D 組，北京、云南、天津、海南種群分布于E 組，廣西種群分布于B、E 組，上海、江蘇和廣東種群分布于D、E 組。 其中新疆、四川、北京種群瓜實(shí)蠅遺傳結(jié)構(gòu)較為單一，同一地區(qū)樣本聚集在一起。 浙江地區(qū)監(jiān)測(cè)到的瓜實(shí)蠅與上海、廣東、江蘇部分監(jiān)測(cè)樣本聚集成一支，上海、廣東監(jiān)測(cè)到的瓜實(shí)蠅個(gè)體分散在進(jìn)化樹的不同支。

圖4 不同地理種群瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本SSR 引物的PCR 擴(kuò)增圖Fig.4 The PCR amplification of B. cucurbitae populations from different regions by using 15 pairs of SSR primers

2.5 瓜實(shí)蠅不同地理種群群體間的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5.1 遺傳一致度和遺傳距離 對(duì)11 個(gè)瓜實(shí)蠅不同地理種群的監(jiān)測(cè)樣本進(jìn)行遺傳一致度和遺傳距離的計(jì)算，對(duì)角線上三角為遺傳一致度，下三角為遺傳距離。 結(jié)果（表6）表明，海南和天津的Nei′s遺傳距離最近，為0.0210，北京和新疆的Nei′s 遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.8207。 遺傳一致度范圍為0.4401 ～0.9792，說(shuō)明瓜實(shí)蠅的不同省市監(jiān)測(cè)樣本之間存在一定的基因交流，不同地區(qū)間的差異不同。

2.5.2 聚類分析 對(duì)11 個(gè)不同省市的瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過(guò)UPGMA 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6 所示，新疆、四川和廣西種群歸為一支（分支4），北京種群聚為一支（分支3），浙江、廣東、江蘇的種群歸為一支（分支2），上海、云南、海南、天津的種群聚為一支（分支1）。

2.5.3 Nei′s 遺傳變異分析 群體遺傳分化分析表明，由Popgene32 軟件聚類分析所得到的11 個(gè)省市監(jiān)測(cè)樣本間基因分化系數(shù)為0.6712，表明瓜實(shí)蠅不同地理種群間遺傳分化，在總的變異中，67.12%的變異發(fā)生在種群間，32.88%的變異發(fā)生在種群內(nèi)部，瓜實(shí)蠅的49 個(gè)監(jiān)測(cè)樣本中總遺傳多樣性和平均遺傳多樣性分別為0.2903 和0.0954，49 個(gè)監(jiān)測(cè)樣本間的基因流較低，為0.2449。

表6 不同地理種群瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本中Nei′s 遺傳一致度和遺傳距離Table 6 Nei′s genetic identity and genetic distance in B. cucurbitae populations from different regions

圖5 不同地理種群瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本基于SSR 多態(tài)性的聚類分析圖Fig.5 The neighbor-joining tree based on SSR data of B. cucurbitae populations from different regions

圖6 基于Nei′s 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離的不同地理種群瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本的聚類圖Fig.6 Dendrogram of B. cucurbitae populations from different regions based on Nei′s standard genetic distance

3 討論

隨著國(guó)際貿(mào)易量及出入境人員交流的增加，越來(lái)越多新鮮水果和蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品通過(guò)口岸出入境，大大增加了危險(xiǎn)性有害生物隨農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易、旅客攜帶或郵寄物等方式入境的可能，進(jìn)而威脅我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)安全（韋兵等，2017）。 在這些有害生物種類中，截獲頻次最高且最具威脅的是實(shí)蠅類害蟲，其主要以幼蟲危害果實(shí)，使受害樹大量落果，受害水果商品價(jià)值受到嚴(yán)重影響。 植物檢疫性實(shí)蠅以離腹寡毛實(shí)蠅屬的害蟲種類最多，如瓜實(shí)蠅等所能造成的危害最嚴(yán)重（李磊等，2018； Mwatawala et al.，2015）。 早在1987 年，日本檢疫部門為防止瓜實(shí)蠅傳入日本地區(qū)，禁止從我國(guó)進(jìn)口葫蘆科瓜果，適逢新疆哈密瓜Cucumis melovar.saccharinus生長(zhǎng)期，經(jīng)過(guò)調(diào)研那時(shí)僅有南方地區(qū)有瓜實(shí)蠅分布，后才解除對(duì)新疆哈密瓜的進(jìn)口限制（張遵雄，1988）。 2006年，中方和日方就中國(guó)蔬菜輸日問題協(xié)商時(shí)曾再次關(guān)注瓜實(shí)蠅在我國(guó)的分布情況（孔令斌等，2008），因此采用分子生物學(xué)方法，利用口岸監(jiān)測(cè)的瓜實(shí)蠅樣本來(lái)研究我國(guó)瓜實(shí)蠅不同地理種群遺傳結(jié)構(gòu)是極有意義的。

本研究發(fā)現(xiàn)，瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)較為豐富，SSR 的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)大于桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalisHendel 轉(zhuǎn)錄組（魏丹丹等，2014）、扶桑綿粉蚧轉(zhuǎn)錄組及齒緣刺獵蝽Sclomina erinaceaStal轉(zhuǎn)錄組（黎東海和趙萍，2019； 羅梅等，2014），可能與物種遺傳信息豐富度、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量、SSR 分析軟件及其篩選標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。 不同地理種群的瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組中的SSR 主要重復(fù)類型為三核苷酸重復(fù)，約占各自總SSR 數(shù)量的1/3 以上，三核苷酸重復(fù)類型更為穩(wěn)定，符合遺傳密碼規(guī)律，與齒緣刺獵蝽轉(zhuǎn)錄組分析一致（黎東海和趙萍，2019）。 本研究在篩選多態(tài)性SSR 引物時(shí)，考慮到低級(jí)單元SSR 的普遍比高級(jí)單元的SSR 具有更為豐富的多態(tài)性（Dreisigacker et al.，2004），結(jié)合SSR 分析數(shù)據(jù)，從SSR 的平均長(zhǎng)度來(lái)看，單核苷酸重復(fù)類型的平均長(zhǎng)度最大，雙核苷酸、三核苷酸次之，但單核苷酸重復(fù)類型錯(cuò)配率較高，因此重點(diǎn)設(shè)計(jì)雙核苷酸及三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星引物，以提高多態(tài)性引物篩選效率。

從本研究監(jiān)測(cè)樣本的聚類結(jié)果來(lái)看，新疆、四川、北京3 個(gè)地區(qū)的瓜實(shí)蠅樣本同一地區(qū)聚集效果較好；浙江的監(jiān)測(cè)樣本與上海、江蘇、廣東的部分樣本聚集成一支，可能與浙江和這3 個(gè)地區(qū)地理距離較為接近，水果運(yùn)輸較為頻繁有關(guān)。 天津、海南、云南和上海、江蘇、廣西、廣東的部分樣本聚集在一起。 總體來(lái)看，上海、廣東、云南的瓜實(shí)蠅監(jiān)測(cè)樣本遺傳多樣性最為豐富，上海和廣東為我國(guó)主要水果進(jìn)境指定口岸，云南的地理位置特殊，與實(shí)蠅高適生區(qū)東南亞接壤，瓜實(shí)蠅流動(dòng)性較強(qiáng)。 不同地理種群瓜實(shí)蠅的種群間系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，基因分化系數(shù)為0.6712，在總的變異中，67.12%的變異發(fā)生在種群間，說(shuō)明這11 個(gè)省市間的瓜實(shí)蠅種群具有不同的遺傳背景。 聚類分析表明，天津、海南、云南、上海聚為一支，浙江、廣東、江蘇聚為一支，北京單獨(dú)聚成一支，廣西、四川、新疆聚為一支。 這些結(jié)果表明，我國(guó)不同口岸的瓜實(shí)蠅具有不同的來(lái)源地，因此具有不同的遺傳背景。 也有部分口岸雖然相距較遠(yuǎn)，但其瓜實(shí)蠅具有相似的遺傳背景，表明可能具有相同的來(lái)源地或者不同來(lái)源地的瓜實(shí)蠅具有相似的遺傳背景。

本研究結(jié)果為檢疫性外來(lái)有害生物監(jiān)測(cè)提供了科學(xué)的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，對(duì)于上海、廣東、云南這3 個(gè)瓜實(shí)蠅遺傳結(jié)構(gòu)較為豐富的地區(qū)，需重點(diǎn)監(jiān)測(cè)瓜實(shí)蠅動(dòng)態(tài)，對(duì)進(jìn)出境水果及由于邊境交流進(jìn)入的檢疫性有害生物需進(jìn)行嚴(yán)格的實(shí)蠅檢疫篩查。對(duì)于新疆、四川、北京地區(qū)瓜實(shí)蠅需進(jìn)行綜合防控，減少其對(duì)外交流，努力控制實(shí)蠅危害范圍。 由于實(shí)蠅具有地理種群差異，后續(xù)可增加監(jiān)測(cè)點(diǎn)，擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)樣本，通過(guò)分析種間進(jìn)化關(guān)系，有望對(duì)瓜實(shí)蠅的來(lái)源地進(jìn)行初步的判斷，為國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端提供談判和解決的依據(jù)。