趙培源，陳少昀，劉喜紅，楊麗萍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

1 多發(fā)性硬化的基本特征

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的慢性炎癥性脫髓鞘疾病。 在大多數(shù)新診斷為MS 的患者中，該疾病始于復(fù)發(fā)緩解期，可能在10 ～15 年后轉(zhuǎn)變?yōu)槔^發(fā)進(jìn)展期。 MS 具有以下基本病理特征：(1)炎癥浸潤。 在MS 患者的病理檢查中，CNS 的炎癥由T細(xì)胞和B 細(xì)胞組成，其中淋巴細(xì)胞的浸潤有CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T 淋巴細(xì)胞參與，但以CD8+T 淋巴細(xì)胞為主，研究證實(shí)，在急性和慢性MS 病變中，CD8+T細(xì)胞超過CD4+T 細(xì)胞數(shù)量近10 倍[1]。 同時，最新臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)靶向B 細(xì)胞有突出的治療效果[2]。 (2)原發(fā)性脫髓鞘。 MS 與腦內(nèi)其他炎癥性疾病的關(guān)鍵不同點(diǎn)是在白質(zhì)和灰質(zhì)中存在廣泛的匯合性原發(fā)性脫髓鞘，導(dǎo)致局灶性的完全脫髓鞘和軸突部分損傷并伴隨少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失。(3)膠質(zhì)細(xì)胞活化。 腦內(nèi)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均參與脫髓鞘和神經(jīng)變性，二者的活化與CNS 炎性反應(yīng)和組織損傷密切相關(guān)[3]，如在慢性病變中，星形膠質(zhì)細(xì)胞常形成致密的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕。

現(xiàn)將MS 模型分為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型、病毒誘導(dǎo)的炎癥性脫髓鞘模型和毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型3 類進(jìn)行介紹。

2 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型(experimentally allergic encephalomyelitis，EAE)是以特異性致敏的CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)為主的自身免疫疾病，是MS 經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動物模型。 EAE 以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為主要特征。 此類模型常使用腦組織勻漿乳液進(jìn)行免疫，并在致敏方案中加入強(qiáng)效佐劑即完全弗式佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)，它能夠提高抗原的免疫反應(yīng)強(qiáng)度并延長免疫反應(yīng)時間[4]，提高模型重復(fù)率，還可以刺激大量吞噬細(xì)胞攝取和呈遞抗原以及CD4+T 細(xì)胞的活化與擴(kuò)增。

然而，EAE 是人工誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，以CD4+T細(xì)胞反應(yīng)為主；而MS 相關(guān)的免疫反應(yīng)以CD8+T 細(xì)胞和B 細(xì)胞為主，故EAE 與MS 仍存在一定差異。

2.1 主動致敏模型

最常見的小鼠主動致敏模型是由CFA 和髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白( myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)35-55肽段誘導(dǎo)[5]，同時腹腔注射具有破壞血腦屏障作用的百日咳毒素[6]，使外周反應(yīng)性T 細(xì)胞得以進(jìn)入CNS 分泌相關(guān)細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[7]。 該模型的優(yōu)點(diǎn)是易于誘導(dǎo)，并可導(dǎo)致脊髓中的急性或者慢性炎性疾病，常用于分析轉(zhuǎn)基因小鼠品系中的分子差異機(jī)制。 但它仍有一定的局限性，作為CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的原發(fā)性軸索損傷的炎癥性腦病模型[8]，其主要病變是伴有繼發(fā)性脫髓鞘的大量軸突變性，而原發(fā)性脫髓鞘較少，這與MS 的病理情況存在差異。 另一個局限性因素是該模型的病理改變主要發(fā)生在脊髓，對大腦的影響較小。

在主動致敏模型中，更接近MS 病理的模型是使用MOG 對大鼠、豚鼠或靈長類動物的活性致敏誘導(dǎo)[9]。 其病理特征是有較大的原發(fā)性脫髓鞘匯合斑塊的形成，這在很多方面與MS 類似，但當(dāng)它們出現(xiàn)在患者身上時，其表型不符合MS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所以與MS 仍然有些差異。

2.2 被動T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型

用腦組織致敏動物后將其外周免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生的T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一組受體動物中，能夠誘導(dǎo)受體動物產(chǎn)生EAE。 也已有實(shí)驗(yàn)成功分離T 細(xì)胞系并在受體動物中克隆，通過髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)引發(fā)腦脊髓炎[10]。 該模型的優(yōu)點(diǎn)是腦內(nèi)炎癥不受外周淋巴組織中特異性免疫激活傳入的影響，且具有高度的可重復(fù)性。 被動轉(zhuǎn)移模型可用于研究控制CNS 免疫監(jiān)視、T 細(xì)胞介導(dǎo)的炎性組織損傷的機(jī)制、T 細(xì)胞進(jìn)入CNS 的方式、T 細(xì)胞的再激活狀態(tài)對神經(jīng)系統(tǒng)的重要性和T細(xì)胞的功能對腦炎癥的影響等。 主要缺點(diǎn)是由CD4+T 淋巴細(xì)胞的被動轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的CNS 炎癥性疾病，沒有廣泛的原發(fā)性脫髓鞘。

2.3 自身反應(yīng)性T 細(xì)胞與致病性自身抗體的被動共轉(zhuǎn)移

在動物體內(nèi)，被動轉(zhuǎn)移自身反應(yīng)性腦源性T 細(xì)胞系誘發(fā)了腦炎癥，再將相應(yīng)的自身抗體注射到動物體內(nèi)[11]。 在這種模型中，T 細(xì)胞反應(yīng)通過激活巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥，并允許抗體和補(bǔ)體因子在炎癥和血腦屏障損傷部位擴(kuò)散到大腦或脊髓。 其優(yōu)點(diǎn)是脫髓鞘由特異性脫髓鞘抗體通過補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞毒性機(jī)制誘導(dǎo)，有廣泛的原發(fā)性炎癥性脫髓鞘，炎癥的產(chǎn)生由T 細(xì)胞介導(dǎo)，伴有巨噬細(xì)胞募集和激活。

該模型首次被應(yīng)用于研究體內(nèi)MOG 抗體的脫髓鞘潛力，結(jié)果表明，在這些條件下，炎癥反應(yīng)與廣泛的原發(fā)性脫髓鞘相關(guān)，其產(chǎn)生的脫髓鞘斑塊也MS 中所見的非常相似。 如今也被用來研究其他抗體的致病潛力，例如靶向神經(jīng)絲氨酸或水通道蛋白4 的抗體。 該模型現(xiàn)已是視神經(jīng)脊髓炎的重要實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚12]，它不僅可以定義患者源性抗水通道蛋白4 自身抗體的發(fā)病作用[13]，還可以確定水通道蛋白4 反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞的作用。 但該模型也存在一定的限制，一方面，臨床上MS 患者一般不會對MOG 產(chǎn)生致病性自身抗體；另一方面，MS 中的免疫學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)表明存在體液脫髓鞘因子，但尚未清楚該因子是自身抗體還是其他炎癥介質(zhì)。

2.4 EAE 的自發(fā)模型

不同的免疫方法可激發(fā)不同的免疫反應(yīng)，這不但影響EAE 的發(fā)病率，還影響疾病發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。 動物自發(fā)的炎癥性脫髓鞘模型可以克服這些問題，該模型通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)T 細(xì)胞受體來完成，T 細(xì)胞可識別腦抗原，如MOG。 這些動物出生時正常，幾個月后出現(xiàn)自發(fā)性炎癥或炎癥性脫髓鞘疾病，發(fā)生率可高達(dá)80%。 此外，該轉(zhuǎn)基因小鼠與B 細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后，可以產(chǎn)生雙轉(zhuǎn)基因的小鼠，但是其CNS 中的原發(fā)性脫髓鞘稀疏，且病變中未觀察到補(bǔ)體的激活。

該模型還適用于研究腸道微生物群在腦部炎癥誘導(dǎo)中的作用[14]，還可解釋抗原表位在慢性腦炎的誘導(dǎo)中的傳播機(jī)制[15]。 其局限性在于CNS 炎癥過程由CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)，缺乏原發(fā)性脫髓鞘。

2.5 人源化的EAE 模型

在使用動物模擬人類MS 時，物種間存在蛋白質(zhì)分子功能的相關(guān)差異，所以在動物實(shí)驗(yàn)時可以對其體內(nèi)分子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)。 當(dāng)T 細(xì)胞在抗原呈遞細(xì)胞中加工并且在主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子的背景下呈現(xiàn)時，它們僅識別各自的抗原，且MHC 在各物種之間是不同的，因此，必須在表達(dá)相應(yīng)人MHC 蛋白的動物中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，才能更好的模擬人類MS[16-17]。 在人MHC I 類或者II 類轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)的EAE 模型，可以用來研究抗原肽。 但是，MS 還受許多其他方面影響[18]，因此，理想的實(shí)驗(yàn)設(shè)計需要多個人源化分子的轉(zhuǎn)基因操作，過程復(fù)雜且技術(shù)上有很大的挑戰(zhàn)性。

2.6 由MHC I 類驅(qū)動的限制性CD8+T 細(xì)胞EAE模型

目前通過主動免疫誘導(dǎo)致病性CD8+T 細(xì)胞自身免疫應(yīng)答存在一定難度。 一項研究通過被動轉(zhuǎn)移MOG 特異性CD8+T 細(xì)胞，并使用MOG33-55致敏誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠產(chǎn)生EAE 模型[19]，其觀察到顯著的MOG 特異性CD8+T 細(xì)胞的應(yīng)答，并在被動轉(zhuǎn)移后誘導(dǎo)了腦炎癥。 已有研究表明，自身反應(yīng)性MHC I 類限制性T 細(xì)胞可以在其他免疫細(xì)胞群的幫助下誘導(dǎo)腦炎癥。 這些CD8+T 細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并且可以破壞CNS 中含有相同抗原的細(xì)胞，在CD8+T 細(xì)胞識別少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的抗原時，會引起原發(fā)性脫髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞的局灶性丟失的局灶性斑塊，產(chǎn)生的CNS 炎癥伴有小膠質(zhì)細(xì)胞的深度激活，但巨噬細(xì)胞募集較少[20]，并且與CD4+T 細(xì)胞相比，CD8+T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通常需要較多數(shù)量的細(xì)胞來誘導(dǎo)腦炎癥和組織損傷。

2.7 用于原發(fā)性或繼發(fā)進(jìn)展性MS 的EAE 模型

在主動免疫后，EAE 動物模型發(fā)展為急性或者慢性疾病，其可維持?jǐn)?shù)月，但是這些模型中的慢性疾病并不是臨床上的進(jìn)展性MS，所以為了再現(xiàn)進(jìn)行性MS 中觀察到的深部軸突和灰質(zhì)損傷，對Biozzi小鼠用神經(jīng)絲-L 致敏，該方法導(dǎo)致急性或者亞急性神經(jīng)炎癥性疾病，有軸突和皮質(zhì)損傷，但是其是由CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的，所以它沒有展現(xiàn)MS 進(jìn)展階段的慢性進(jìn)展性疾病特征。

深度的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和皮質(zhì)脫髓鞘是進(jìn)展性MS 關(guān)鍵的病理特征[21]。 深度的小膠質(zhì)細(xì)胞激活與MS 患者腦中脫髓鞘和神經(jīng)變性的進(jìn)展相關(guān)，所以可以在具有高先天免疫激活遺傳背景的小鼠中誘導(dǎo)進(jìn)展性MS 模型，這在非肥胖糖尿病小鼠品系中得到實(shí)現(xiàn)[22]，它們可發(fā)展為慢性進(jìn)行性EAE模型，脊髓中有大量損傷，但是其病理改變大部分是繼發(fā)性的脫髓鞘和顯性軸突損傷，只有少量的原發(fā)性脫髓鞘。 皮質(zhì)的脫髓鞘在疾病早期階段出現(xiàn)，在患者發(fā)展為進(jìn)行性MS 時大量增加，活躍的皮質(zhì)脫髓鞘發(fā)生在腦膜炎癥部位。 用MOG1-125致敏的大鼠和靈長類動物的EAE 模型中[23]，發(fā)現(xiàn)了腦膜炎癥和與腦膜炎癥相關(guān)的皮質(zhì)、皮下脫髓鞘，免疫病理學(xué)研究表明，這些病變是由炎癥介質(zhì)和脫髓鞘抗體共同觸發(fā)的，但是MS 患者的皮質(zhì)病變是由脫髓鞘自身抗體還是未知的炎癥介質(zhì)所介導(dǎo)目前尚未清楚。

3 病毒誘導(dǎo)的炎癥性脫髓鞘

3.1 Theiler 病毒誘導(dǎo)的慢性脫髓鞘腦脊髓炎

小鼠Theiler 腦脊髓炎病毒(Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV)直接腦內(nèi)感染可誘導(dǎo)動物出現(xiàn)急性腦脊髓炎。 TMEV 誘導(dǎo)限于一些易感小鼠[24]，如SJL/J 品系，致病部位主要在脊髓，模擬慢性漸進(jìn)性MS，其各項指標(biāo)與MS 非常類似：炎性浸潤由CD4+、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和漿細(xì)胞組成；脫髓鞘發(fā)生在小膠質(zhì)細(xì)胞活化的部位。 所以TMEV誘導(dǎo)的MS 模型比EAE 更加接近臨床。

目前，TMHV 模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究CNS中病毒的清除機(jī)制[25]。 同時，該模型還可以用來確定不同淋巴細(xì)胞群在致病過程中的作用。 它的局限性在于：病毒介導(dǎo)的脫髓鞘炎癥并不能反映出MS脫髓鞘和軸索損傷過程；盡管病毒感染程度與MS臨床癥狀有一定的相關(guān)性，但與脫髓鞘并無直接因果關(guān)系；TMHV 模型的發(fā)病機(jī)制仍有待研究。

3.2 小鼠肝炎(冠狀)病毒誘發(fā)的慢性炎癥性脫髓鞘疾病

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)可以誘導(dǎo)脫髓鞘腦脊髓炎，該模型病理特征包括：慢性炎癥浸潤、原發(fā)性的脫髓鞘及軸突和軸索損傷。炎性浸潤主要由T 淋巴細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞組成，同時，鞘內(nèi)免疫球蛋白的產(chǎn)生也表明B 細(xì)胞和漿細(xì)胞在炎癥過程中起主要作用[26]。 MHV 模型的特性為：炎性脫髓鞘與大量小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)，這種激活可見于整個大腦和脊髓，并且有氧自由基的表達(dá)；炎性脫髓鞘由感染過程引起，而非腦組織活躍敏感引起的，這是更自然的一個過程。 缺點(diǎn)是其炎癥和脫髓鞘的機(jī)制尚不明確[27]。

4 毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型

4.1 Cuprizone 誘導(dǎo)脫髓鞘和髓鞘再生

雙環(huán)己酮草酰雙腙(cuprizone，CPZ)可以通過氧化損傷機(jī)制誘導(dǎo)脫髓鞘。 脫髓鞘和髓鞘再生的過程由炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大或修飾，并涉及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[28]。 C57BL/6 小鼠是目前發(fā)病率最高的品系，對其使用CPZ 4 周即可建立MS 模型[29]。 該模型的優(yōu)點(diǎn)是用藥后在CNS 特定區(qū)域產(chǎn)生原發(fā)性脫髓鞘，這為促進(jìn)脫髓鞘再生相關(guān)藥物的研發(fā)及機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。 但在停止CPZ 后，該模型大腦胼胝體通常會出現(xiàn)自發(fā)性髓鞘再生。完全髓鞘再生時，也可能伴隨進(jìn)行性神經(jīng)干細(xì)胞生成。 為了解決CPZ 模型快速髓鞘再生的問題，可以將動物暴露于CPZ 12 周來開發(fā)第二種模型[30]，其特點(diǎn)是存在慢性脫髓鞘和少量的髓鞘再生[31]。

4.2 局灶性毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型

溶血卵磷脂可在短時間內(nèi)誘導(dǎo)炎性脫髓鞘病變，給藥方式一般采用CNS 局部注射。 這是一種高度可重復(fù)的局灶性原發(fā)脫髓鞘模型，但髓鞘破壞后會很快出現(xiàn)髓鞘再生，髓鞘再生的速度和程度與年齡有關(guān)。 溴化乙錠局部注射到白質(zhì)束引起的脫髓鞘模型也是常用的毒性脫髓鞘模型之一[32]，注射3周左右會在該部位及周邊區(qū)域發(fā)生炎癥脫髓鞘，并伴隨少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的病變。

毒素模型為研究脫髓鞘和髓鞘再生機(jī)制提供了很好的線索。 它們表明了髓鞘再生不僅可以改善軸突的功能，還可以保護(hù)神經(jīng)。

5 總結(jié)與展望

MS 實(shí)驗(yàn)動物模型的作用在于幫助人們研究和預(yù)測疾病并探索相應(yīng)的治療方法。 盡管目前仍沒有一種動物模型能完全呈現(xiàn)MS 的臨床和病理特征，但是可供選擇的模型種類較多，因此，可以根據(jù)研究內(nèi)容有針對性選擇相應(yīng)的MS 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?在研究新的治療方法時，這些模型也可以為積極的治療效果提供原理證據(jù)。 理想的動物模型應(yīng)該能模擬MS 的所有特征，所以我們需要進(jìn)一步改進(jìn)，更好的反映疾病的致病機(jī)制和異質(zhì)性。