王明亮，丁永芳，印鑫，邵久針，莊子銳，張婷，蘇鵬亮，彭蘊(yùn)茹*

(1. 江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028)

藥物毒性是藥物研發(fā)面臨的主要問(wèn)題之一，也是藥物導(dǎo)致發(fā)病以及死亡的主要原因，在很大程度上限制了藥物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用[1]。 在大多數(shù)常規(guī)臨床前實(shí)驗(yàn)中，藥物接觸到的都是近親繁殖的動(dòng)物，數(shù)量可能還不到1000 只，這限制了實(shí)驗(yàn)中獨(dú)立基因型的數(shù)目，不利于發(fā)現(xiàn)許多基因依賴(lài)型的藥物不良反應(yīng)事件。 而每條雌性斑馬魚(yú)1 次能產(chǎn)生200 ～300 個(gè)卵，可以將其放入96 或384 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，斑馬魚(yú)胚胎能夠依靠卵黃囊中的營(yíng)養(yǎng)存活，這使得即便是一個(gè)小的實(shí)驗(yàn)室也可以達(dá)到成千上萬(wàn)，甚至上千萬(wàn)的培養(yǎng)規(guī)模[2]。 斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均可以達(dá)到相近的數(shù)量規(guī)模，且斑馬魚(yú)作為一個(gè)完整的有機(jī)體，又能夠?qū)λ幬镞M(jìn)行吸收、代謝、分布、排泄，可以用于研究器官間的相互作用以及免疫反應(yīng)等。 所以近年來(lái)斑馬魚(yú)的應(yīng)用十分廣泛，本文將對(duì)于斑馬魚(yú)在毒理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 斑馬魚(yú)

斑馬魚(yú)是一種脊椎動(dòng)物，斑馬魚(yú)基因與人類(lèi)基因組相比同源性達(dá)70%，人類(lèi)疾病相關(guān)基因有82%能在斑馬魚(yú)中找到同源基因，全基因組相似性達(dá)87%[3]。 斑馬魚(yú)本身對(duì)水質(zhì)要求并不高，pH 在6.5～7.5 之間，溫度則在28.5℃左右，水中含氧量60% ～90%飽和度；14 h 光照/10 h 黑暗循環(huán)對(duì)繁殖期的斑馬魚(yú)產(chǎn)卵有利。 斑馬魚(yú)的胚胎在72 h 左右除胃腸道之外的器官基本發(fā)育完成，96 h 左右全部器官發(fā)育完成，3 個(gè)月左右達(dá)到性成熟；由于斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育周期比嚙齒類(lèi)動(dòng)物短，縮短了進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)間。 成年魚(yú)體約3 ～4 cm，一條雌性斑馬魚(yú)一次可以產(chǎn)下200 ～300 顆卵，斑馬魚(yú)的胚胎僅1 mm 左右，在受精后的72 h 內(nèi)具有光學(xué)透明性，使得其可以在不用殺死動(dòng)物的情況下對(duì)器官的形態(tài)功能進(jìn)行連續(xù)的檢測(cè)。 魚(yú)體小，數(shù)量大，可以活體觀察，令實(shí)驗(yàn)可以連續(xù)的獲取大量信息，并且花費(fèi)沒(méi)有嚙齒類(lèi)動(dòng)物那么昂貴。 此外斑馬魚(yú)胚胎容易從周?chē)招》肿咏橘|(zhì)(酒精、尼古丁和布洛芬等化合物)，對(duì)于微量小分子的毒性測(cè)試更為便捷[2，4]。 當(dāng)藥物十分貴重或不易獲得時(shí)，相對(duì)于細(xì)胞檢測(cè)，斑馬魚(yú)作為一個(gè)完整的生命體對(duì)于藥效或毒性的檢測(cè)更具有說(shuō)服力。 在完成斑馬魚(yú)基因組計(jì)劃后，斑馬魚(yú)的cDNA 文庫(kù)也均可以免費(fèi)使用，這使得斑馬魚(yú)可提供大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尤其適用于高通量篩選作用靶點(diǎn)和藥物毒性成分。 斑馬魚(yú)本身也存在局限性，常用的斑馬魚(yú)給藥是將藥物溶解在水中，這對(duì)于研究水溶性差的藥物則給藥量可能達(dá)不到相應(yīng)的暴露劑量，限制了對(duì)于藥物篩選和毒性檢測(cè)的范圍；此外，由于斑馬魚(yú)生活在藥物處理的水中，可能會(huì)產(chǎn)生一些獨(dú)特的區(qū)別于哺乳類(lèi)動(dòng)物的反應(yīng)[5]。

通過(guò)PubMed 檢索“zebrafish”發(fā)現(xiàn)近3 年，斑馬魚(yú)的文獻(xiàn)數(shù)量年均3000 左右，采用斑馬魚(yú)的研究主要集中在發(fā)育系統(tǒng)，肝以及神經(jīng)系統(tǒng)方面，文獻(xiàn)數(shù)量相比較于2000 年已經(jīng)翻了近5 倍，這也間接表明了斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的潛力[5]。

2 斑馬魚(yú)在毒理學(xué)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)在藥物毒性篩選方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)，在毒性檢測(cè)中斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物的評(píng)價(jià)一致性達(dá)到55% ～100%，在已知的胎兒毒性篩選中，大鼠檢測(cè)出79%，小鼠檢測(cè)出75%，兔子檢測(cè)出75%，然而在大鼠，小鼠和兔子之間的一致性也只是56%，這表明斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物的一致性大體相同，支持斑馬魚(yú)在毒理學(xué)中的應(yīng)用[6]。 但是由于斑馬魚(yú)的魚(yú)體小，單個(gè)斑馬魚(yú)樣本無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，只能收集足夠多的樣本后進(jìn)行集中處理檢測(cè)，這是斑馬魚(yú)的不足同時(shí)也是其優(yōu)勢(shì)所在，體積小使得其可以達(dá)到相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模，又能提供完整的生物有機(jī)體代謝反應(yīng)，使得斑馬魚(yú)檢測(cè)毒性的結(jié)果是基于大量的動(dòng)物體實(shí)驗(yàn)獲得的，更加具備說(shuō)服力。

值得注意的是斑馬魚(yú)胚胎對(duì)于藥物毒性的敏感性還在一定程度上高于哺乳動(dòng)物，Alzualde 等[7]在分析阻燃劑毒性時(shí)，通過(guò)生物檢測(cè)(人類(lèi)血漿，乳液等) 和高通量毒代動(dòng)力學(xué)模型，預(yù)估阻燃劑(BDE47 等)在人類(lèi)血漿中的濃度，對(duì)比得到斑馬魚(yú)體內(nèi)最低有效水平(the lowest effective levels，LELs)，發(fā)現(xiàn)阻燃劑在斑馬魚(yú)體內(nèi)暴露水平(＞1 μmol/L)高于人體水平(＜1 μmol/L)，進(jìn)一步表明斑馬魚(yú)胚胎對(duì)于一些低毒或者毒性表現(xiàn)不明顯的藥物毒性檢測(cè)具有顯著意義。 與直接對(duì)比斑馬魚(yú)培養(yǎng)液中的濃度相比，對(duì)比斑馬魚(yú)體內(nèi)濃度與人類(lèi)血漿濃度，結(jié)果更有說(shuō)服力。 但是Alzualde 等[7]對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)藥物濃度進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，是將斑馬魚(yú)幼體收集起來(lái)，集中采用UPLC/MS 進(jìn)行藥物濃度的檢測(cè)，以每個(gè)幼體(受精后4 d 的斑馬魚(yú)幼體)0.4 μL的體積來(lái)估算斑馬魚(yú)的體內(nèi)濃度，這個(gè)方法解決了一部分斑馬魚(yú)用藥劑量與人類(lèi)血藥濃度關(guān)聯(lián)性的問(wèn)題，但是完全忽略了個(gè)體差異以及藥物在體內(nèi)分布差異，獲得的僅是藥物體內(nèi)濃度的平均數(shù)，所以在使用斑馬魚(yú)時(shí)需要更多地考慮到藥物劑量與臨床數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化方面的問(wèn)題，增加相關(guān)方面的研究，解決了這個(gè)問(wèn)題將極大地?cái)U(kuò)展斑馬魚(yú)在藥理毒理實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。

2.1 心臟毒性

心臟祖細(xì)胞在斑馬魚(yú)受精后5 h 左右形成，48 h左右形成瓣膜，胚胎心率每分鐘140 ～180，比起小鼠(每分鐘300 ～600 次)更接近于人類(lèi)正常胎心率(每分鐘130 ～170 次)[8]。 在受精后48 h 內(nèi)，斑馬魚(yú)的心臟電生理和收縮生理與成年人相似，正常斑馬魚(yú)心臟電生理對(duì)鈣電流的最初依賴(lài)在1 ～2 d內(nèi)被一個(gè)更全面的系統(tǒng)(離子電流)所取代，而離子電流是成人心臟電生理的重要代表[9-10]，因此比起嚙齒類(lèi)動(dòng)物，斑馬魚(yú)的心臟電生理與人類(lèi)更為接近。 在受精后48 h 內(nèi)斑馬魚(yú)的心臟就具有復(fù)雜的離子通道和功能代謝[2]，比起人類(lèi)胎兒在15 ～16 d 心臟祖細(xì)胞形成和28 d 左右心臟形成瓣膜，斑馬魚(yú)發(fā)育周期要明顯比人類(lèi)短，但是早期發(fā)育情況及細(xì)胞形態(tài)與人類(lèi)十分接近，使斑馬魚(yú)進(jìn)行心臟方面的研究更節(jié)約時(shí)間、更便捷[4]。 而斑馬魚(yú)心臟結(jié)構(gòu)與人類(lèi)不一致的是，斑馬魚(yú)的心臟由瓣膜分隔為一個(gè)心房和一個(gè)心室，而人類(lèi)的心臟由瓣膜和隔膜分隔為四個(gè)腔室。 雖然心臟結(jié)構(gòu)不一致，但是斑馬魚(yú)與人類(lèi)心臟發(fā)育的細(xì)胞和分子機(jī)制均高度保守，并且在48 h 內(nèi)可以直接通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行觀察，記錄心臟的發(fā)育過(guò)程，血液流動(dòng)變化等情況[4，11]。 心臟熒光轉(zhuǎn)基因(cmlc2：GFP)斑馬魚(yú)的應(yīng)用使得對(duì)于成年/較厚較老的魚(yú)體的心臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察更清晰，進(jìn)一步擴(kuò)大了斑馬魚(yú)的應(yīng)用[12]。

QT 期延長(zhǎng)是在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中常見(jiàn)的一種心臟毒性，Milan 等[9]研究了一種高通量檢測(cè)藥物導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)緩的方法，檢測(cè)了100 種藥物，發(fā)現(xiàn)了23種藥物(其中22 種會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)QT 期延長(zhǎng))導(dǎo)致了斑馬魚(yú)QT 期延長(zhǎng)；此外該方法還能檢測(cè)藥物與藥物間(紅霉素和西沙必利，西咪替丁和特非那定)相互作用產(chǎn)生的心臟毒性。 在研究尼古丁暴露對(duì)心臟功能的影響時(shí)，采用斑馬魚(yú)胚胎接觸不同濃度(5～40 μmol/L)的尼古丁后檢測(cè)心率，結(jié)果與大鼠及綿羊動(dòng)物模型相似，尼古丁暴露對(duì)心臟功能表現(xiàn)出劑量依賴(lài)效應(yīng)，低劑量時(shí)引起心動(dòng)過(guò)速，高劑量時(shí)引起心動(dòng)過(guò)緩[13-14]。 Park 等[15]發(fā)現(xiàn)暴露于15 ～30 μmol/L 氟蟲(chóng)脲的斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)生了畸形的眼和心臟，卵黃囊水腫等病理情況，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控基因cyclin D1 (ccnd1)，ccne1，cyclindependent kinase 2 (cdk2)和cdk6，血管生成相關(guān)基因vascular endothelial growth factor Aa (vegfaa)，vegfc，fms-related tyrosine kinase 1 (flt1)和flt4 均受到抑制，證明氟蟲(chóng)脲有抑制發(fā)育和心血管生成的毒性作用，并且這一結(jié)果得到了體外血管生成模型(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，HUVECs)的進(jìn)一步驗(yàn)證。 證明斑馬魚(yú)無(wú)論在發(fā)育時(shí)間，心臟的生理特性，還是相關(guān)基因靶點(diǎn)的調(diào)控，均與人類(lèi)相似，在藥物心臟毒性及毒性機(jī)制的研究上均有很大的應(yīng)用前景。

2.2 肝毒性

除肝中的常駐巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞)外，哺乳類(lèi)動(dòng)物肝中的所有細(xì)胞均能在斑馬魚(yú)中找到相對(duì)應(yīng)的存在[16]。 斑馬魚(yú)肝在受精后28 h 左右開(kāi)始發(fā)育時(shí)，其生長(zhǎng)因子以及基因表達(dá)與人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物相似，在78 h 時(shí)肝發(fā)育基本完成，并具有肝的基本功能[17-18]。 但是斑馬魚(yú)肝的結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物不一致，斑馬魚(yú)的肝實(shí)質(zhì)不是由膽總管、門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈組成的，而是隨機(jī)分布的；哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞呈板狀排列，而斑馬魚(yú)的肝細(xì)胞呈小管狀排列，這些小管形成運(yùn)輸膽汁的通道，形成肝內(nèi)膽管[19]。

在進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)時(shí)，有些藥物本身并沒(méi)有毒性，但是在肝代謝后產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)于機(jī)體會(huì)產(chǎn)生毒性，這使得用細(xì)胞檢測(cè)這部分藥物毒性時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性的情況，肝中的細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)則是肝中代謝的主要承擔(dān)者[19]。 在斑馬魚(yú)體內(nèi)的細(xì)胞色素體系與人類(lèi)和嚙齒類(lèi)十分相似，布洛芬在人體內(nèi)是通過(guò)CYP2C8/9 亞型催化代謝為羥化布洛芬，在給予斑馬魚(yú)胚胎布洛芬后，可在水體中以及胚胎體內(nèi)提取到羥化布洛芬，表明斑馬魚(yú)體內(nèi)有類(lèi)似于人體的CYP2C8/9 體系[19-20]。此外在鎘(Cd2+)和2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二噁英(TCDD)對(duì)水生生物毒性的研究中[21]，發(fā)現(xiàn)10% ～100% LC50(LC50=126 μM)濃度Cd2+以及3 ～30 nmol/L 濃度TCDD 對(duì)斑馬魚(yú)的CYP1A1 的表達(dá)有影響，且雌性斑馬魚(yú)的CYP1A1 基因表達(dá)量高于雄性斑馬魚(yú)。 在使用已知的肝毒性藥物時(shí)(如四環(huán)素，阿司匹林，紅霉素，環(huán)孢素A，胺碘酮，對(duì)乙酰氨基酚等)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)檢測(cè)出的結(jié)果表現(xiàn)出與人類(lèi)巨大的一致性；研究表明對(duì)于外來(lái)的化學(xué)物質(zhì)，斑馬魚(yú)與人類(lèi)一樣具有酶誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有與哺乳類(lèi)動(dòng)物同系的脂質(zhì)代謝酶，包括3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，PPARs(peroxisome proliferatoractivated receptors，PPARs)等[5，22-23]。 總體而言，斑馬魚(yú)對(duì)藥物的代謝與人類(lèi)十分相似，可以作為一個(gè)良好的肝毒性檢測(cè)模型，斑馬魚(yú)的光學(xué)透明性還使其可以采取熒光染色觀察脂質(zhì)體的運(yùn)動(dòng)，在進(jìn)行一定的肝特異型誘導(dǎo)表達(dá)模型后，也可以直觀地觀察到肝的發(fā)生、發(fā)育、肝毒性藥物的作用動(dòng)態(tài)情況或疾病的進(jìn)展，張力等[24]用重組質(zhì)粒pfabp10-rtTA聯(lián)合pTRE-Tight-BI-AcGFP1 構(gòu)建了一個(gè)四環(huán)素誘導(dǎo)肝特異表達(dá)綠色熒光蛋白的斑馬魚(yú)模型，可以在30 μg/mL 的四環(huán)素誘導(dǎo)下在肝位置表達(dá)熒光蛋白，為研究肝臟相關(guān)疾病提供了良好的斑馬魚(yú)模型。

2.3 腎毒性

胚胎期的斑馬魚(yú)腎與人類(lèi)有很高的同源性，并且發(fā)育周期短，斑馬魚(yú)的腎在受精后14 h 開(kāi)始發(fā)育，在72 h 內(nèi)腎發(fā)育完成，許多在人體中能產(chǎn)生腎毒性的藥物在斑馬魚(yú)中都能得到相似的結(jié)果[25]。Gorgulho 等[26]利用慶大霉素、撲熱息痛和替諾福韋10%致死濃度來(lái)評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)腎小管毒性模型有效性，結(jié)果表明撲熱息痛的代謝是通過(guò)與谷胱甘肽結(jié)合和氧化來(lái)完成的。 慶大霉素和撲熱息痛可降低腎清除率，撲熱息痛和替諾福韋會(huì)擴(kuò)大近端小管，這三個(gè)藥物都會(huì)引起線(xiàn)粒體改變，包括畸形形狀、線(xiàn)粒體腫脹、嵴破壞和/或基質(zhì)顆粒丟失。 這些結(jié)果與慶大霉素、撲熱息痛和替諾福韋對(duì)人的管狀效應(yīng)一致，表明斑馬魚(yú)幼魚(yú)可能是評(píng)估與藥物性腎損傷相關(guān)的功能和結(jié)構(gòu)損傷的良好模型。 此外，Judit等[1]利用撲熱息痛、替諾福韋和替諾福韋酯10%致死濃度處理斑馬魚(yú)胚胎，分析其代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)腺苷和色氨酸與對(duì)乙酰氨基酚毒性作用有關(guān)，黃嘌呤和氧化谷胱甘肽與替諾福韋的毒性作用相關(guān)，可能是這些代謝產(chǎn)物影響了線(xiàn)粒體，誘導(dǎo)了腎小管損傷。王雪等[25]采用Tg(wt1b：GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(即在前腎的腎小球、前腎管及近端前腎弓區(qū)域表達(dá)綠色熒光蛋白)研究馬兜鈴酸A 的腎毒性，發(fā)現(xiàn)40 ～80 μmol/L 馬兜鈴酸A 處理后斑馬魚(yú)的腎小球及前腎管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，排列疏松；qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20 μmol/L 馬兜鈴酸A 處理24 h 后nephrin(nephrin蛋白表達(dá)于腎小球足細(xì)胞，與裂孔隔膜的形成相關(guān))表達(dá)顯著降低，表明馬兜鈴酸A 造成蛋白尿的原因可能是由于損傷了腎小球足細(xì)胞。 證實(shí)斑馬魚(yú)是研究藥物對(duì)于腎毒性作用的良好模型，并可以利用斑馬魚(yú)模型進(jìn)一步研究藥物腎毒性的作用機(jī)制。

2.4 神經(jīng)毒性

神經(jīng)毒物的基本作用可以通過(guò)破壞神經(jīng)分化、增殖、遷移、生長(zhǎng)、突觸形成和神經(jīng)回路發(fā)育來(lái)實(shí)現(xiàn)[27]。 用斑馬魚(yú)研究神經(jīng)毒性時(shí)，除了觀察捕食，游泳，刺激活動(dòng)等常規(guī)活動(dòng)之外，還可以檢測(cè)成癮、焦慮、攻擊性、學(xué)習(xí)/記憶、運(yùn)動(dòng)、社會(huì)反應(yīng)、反掠奪性行為和配偶選擇等行為特征[27]。 例如ASD(Autism spectrum disorder，ASD)患者模型，各種斑馬魚(yú)基因修飾模型(單基因突變模型如MECP2，AUTS2，CHD8 等)均能夠表現(xiàn)出與ASD 患者相似的社交障礙及刻板行為[28]。 胎兒酒精綜合征會(huì)產(chǎn)生對(duì)于身體以及認(rèn)知的特異性異常，包括注意力不集中，記憶力和認(rèn)知缺陷等，這點(diǎn)在人類(lèi)[29]、嚙齒類(lèi)動(dòng)物[30]以及斑馬魚(yú)[31]身上均得到驗(yàn)證，并且胚胎酒精暴露處理后，在很低的劑量下就會(huì)對(duì)大腦發(fā)育產(chǎn)生影響。 在一項(xiàng)研究中[31]發(fā)現(xiàn)暴露于3 ～300 mmol/L 酒精中的斑馬魚(yú)胚胎，在成年后進(jìn)行的空間交替實(shí)驗(yàn)(動(dòng)物在給予刺激后作出交替反應(yīng)，是一種用于檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)能力的實(shí)驗(yàn))中，與未暴露于酒精的斑馬魚(yú)相比，即便是暴露于低劑量酒精(10 mmol/L)的斑馬魚(yú)犯錯(cuò)也明顯增多，酒精濃度越高斑馬魚(yú)在空間交替實(shí)驗(yàn)中犯錯(cuò)越多，呈劑量依賴(lài)性。 Nam 等[32]研究紅參對(duì)感覺(jué)神經(jīng)損傷時(shí)，用四氧嘧啶(濃度為0 μmol/L，100 μmol/L，300 μmol/L，500 μmol/L)處理斑馬魚(yú)胚胎，造成糖尿病神經(jīng)肥大斑馬魚(yú)模型(Alloxan-induced diabetic neuromast，AIDN)，其中O1(Otic 1 hair cell，O1)，L1(Lateral neuromast 1，L1)，L4 及終端神經(jīng)丘隨時(shí)間和劑量呈下降趨勢(shì)，用紅參治療后可能通過(guò)增加trkA、TRPV1和p-MAPK 的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)通路改善AIDN 造成的損傷。 Leung 等[33]通過(guò)無(wú)偏倚的、全腦范圍的活動(dòng)記錄，結(jié)合對(duì)眼球運(yùn)動(dòng)、肌肉動(dòng)態(tài)和心率的評(píng)估，證明斑馬魚(yú)至少有兩種主要的睡眠特征，與哺乳類(lèi)動(dòng)物的快波睡眠及慢波睡眠相近，表明人類(lèi)可能在4.5 億年前就出現(xiàn)了睡眠神經(jīng)信號(hào)；Oikonomou 等[34]發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)和小鼠睡眠的開(kāi)始與維持均與中縫對(duì)5-羥色胺產(chǎn)生的基因消除相關(guān)，解決了5-羥色胺對(duì)睡眠影響的爭(zhēng)議。 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型還可以應(yīng)用于抑郁癥、焦慮癥、帕金森氏病、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏舞蹈病等相關(guān)精神疾病的研究[35-36]，表明斑馬魚(yú)十分適用對(duì)神經(jīng)毒性及其毒性機(jī)制的研究，并且已經(jīng)有許多成熟的測(cè)試神經(jīng)方面行為特征的方法。

2.5 多代和跨代毒性

多代和跨代毒性研究是指生物對(duì)外源物質(zhì)接觸后對(duì)該生物后代(在后代沒(méi)有接觸該外源物質(zhì)的情況下)的影響，表觀遺傳改變被認(rèn)為是遺傳毒性的主要機(jī)制，遺傳細(xì)胞DNA 甲基化被認(rèn)為是主要原因，而許多涉及多代和跨代毒性的物質(zhì)并不是基因毒性的[6]。 多代毒性研究觀察最初接觸外源物質(zhì)的幾代人，是否可以觀察到毒性效應(yīng)，無(wú)論其是否成年；在跨代毒性研究中，則是在這幾代人(初代接觸后)中并沒(méi)有接觸到該外源物質(zhì)的情況下，觀察是否產(chǎn)生毒性效應(yīng)[6]。 在表觀遺傳學(xué)研究中，斑馬魚(yú)是一種合適的脊椎動(dòng)物模型，因?yàn)榕c哺乳動(dòng)物具有相似的DNA 甲基化模式，并且表現(xiàn)出DNA 甲基化和其他表觀遺傳途徑的保守性[37]。 斑馬魚(yú)可進(jìn)行體外受精，并且性成熟僅需3 ～4 個(gè)月左右，可以進(jìn)行相對(duì)較短時(shí)間的“傳代”，又可大規(guī)模地進(jìn)行觀察，且斑馬魚(yú)屬于體外受精，受精后直接暴露于斑馬魚(yú)胚胎意味著F0 代直接暴露，同時(shí)直接發(fā)育的胚胎即為F1 代，則F2 代是第一個(gè)完全沒(méi)有暴露的后代，與哺乳類(lèi)動(dòng)物F3 代(完全未暴露)有一定的差異[38]。 對(duì)于多代和跨代毒性研究十分適用。 在將受精后6 ～120 h 的斑馬魚(yú)胚胎暴露于5 ～10 μmol/L 苯并芘中，在無(wú)化學(xué)物質(zhì)的水中培養(yǎng)直至成年，研究苯并芘暴露對(duì)斑馬魚(yú)3 代的影響[39]，F(xiàn)0 和F2 幼體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)、心跳減慢和線(xiàn)粒體功能減退；F2 代的斑馬魚(yú)性別特異性體重指數(shù)(BMI)增加、耗氧量增加和過(guò)度回避行為，表明暴露于苯并芘會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)行為和生理缺陷的跨代遺傳。 此外在發(fā)育過(guò)程中苯并芘暴露導(dǎo)致野生型斑馬魚(yú)的整體DNA 甲基化水平降低，DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)普遍降低，而后者的作用在AHR2-null背景下基本逆轉(zhuǎn)。 趙維超等[40]在研究γ 射線(xiàn)輻照對(duì)人體的影響時(shí)，采用0.01 ～1.0 Gy 的γ 射線(xiàn)輻照受精后5 h 的斑馬魚(yú)胚胎，發(fā)現(xiàn)大于0.1 Gy 的輻照劑量時(shí)胚胎的存活率，孵化率都顯著低于對(duì)照組，致畸率則顯著升高，呈劑量依賴(lài)性；在0.01 Gy 時(shí)DNA 出現(xiàn)損傷，劑量增大時(shí)損傷也加劇。 Kamstra 等[41]發(fā)現(xiàn)在受精后0 ～6 d 斑馬魚(yú)胚胎直接接觸5-氮雜胞苷(5-AC)，對(duì)后代的幼體長(zhǎng)度有影響，并且在F1 和F2 代斑馬魚(yú)成年精子樣本中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6 個(gè)位點(diǎn)存在甲基化差異；對(duì)于MEHP(Mono(2-ethylhexyl)phthalate，MEHP)則發(fā)現(xiàn)在F1 和F2 代中有兩個(gè)甲基化位點(diǎn)存在差異，證實(shí)了5-AC 與MEHP 的DNA甲基化跨代影響。 這證明斑馬魚(yú)模型在多代和跨代遺傳毒性及機(jī)制研究中的應(yīng)用價(jià)值。

2.6 致畸毒性

斑馬魚(yú)從受精到各個(gè)器官發(fā)育基本完成只需要96 h 左右，再到出生成為幼魚(yú)，只需要幾天就基本完成胚胎發(fā)育，相比較于嚙齒類(lèi)動(dòng)物妊娠21 d 左右，縮短了觀察時(shí)間，此外在一系列模型中對(duì)致畸性的小規(guī)模研究表明，斑馬魚(yú)的致畸效果與包括人類(lèi)在內(nèi)的其他模型中觀察到的效果之間存在良好的相關(guān)性[2]。 并且斑馬魚(yú)胚胎的體外發(fā)育，光學(xué)透明性以及體積小，使得觀察斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育十分簡(jiǎn)便。 但是與之相對(duì)應(yīng)的是斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育離開(kāi)了雌性斑馬魚(yú)的子宮，也就是失去了胎盤(pán)作為子代與母親的聯(lián)系，使得一些本可以通過(guò)母體進(jìn)入子代的抗體等免疫物質(zhì)不能進(jìn)入，這也是一個(gè)影響因素，不過(guò)這不影響斑馬魚(yú)作為一個(gè)研究致畸毒性的良好模型。 Kawada 等[42]用浸泡過(guò)羽毛和羽絨材料的無(wú)菌水培養(yǎng)正常斑馬魚(yú)胚胎(受精5 h 后)，72 h后發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)出現(xiàn)尾部的彎曲，短缺以及心包水腫的現(xiàn)象，通過(guò)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(mpeg1：EGFP，巨噬細(xì)胞EGFP)發(fā)現(xiàn)羽毛和羽絨材料能夠使得斑馬魚(yú)尾鰭中巨噬細(xì)胞的含量增加，表明這些樣本在人類(lèi)中使用可能會(huì)導(dǎo)致炎癥。 這證明斑馬魚(yú)胚胎毒性檢測(cè)是一個(gè)合適的致畸實(shí)驗(yàn)的替代模型，具有足夠高的靈敏性以及實(shí)施的方便性，此外實(shí)驗(yàn)斑馬魚(yú)的費(fèi)用可能只有嚙齒類(lèi)動(dòng)物的1/500-1/1000，有足夠的經(jīng)濟(jì)效益，使用熒光蛋白標(biāo)記的斑馬魚(yú)還能夠檢測(cè)一些低毒性藥物，能夠顯示出具體的表型。

2.7 其他

在斑馬魚(yú)受精后的第4 ～5 天左右，腸道收縮能力開(kāi)始顯現(xiàn)，可用于定量估計(jì)藥物對(duì)于腸道運(yùn)動(dòng)的影響[2，43]。 斑馬魚(yú)還可以用少量的二乙基亞硝胺(DEN)等物質(zhì)誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生，作為研究癌癥的模型；斑馬魚(yú)的基因組已經(jīng)測(cè)序完成，并且有許多的基因工具可以進(jìn)行使用；相比于嚙齒類(lèi)動(dòng)物用藥需要幾克幾十克，斑馬魚(yú)的用藥量可以控制在微克或毫克級(jí)別，用量十分小，可以用于研究一些珍貴或不易獲得的藥物的吸收、分布、代謝、排泄等。 此外斑馬魚(yú)作為水生生物還可以用于研究水體環(huán)境的污染程度等，應(yīng)用范圍十分的寬廣。

3 斑馬魚(yú)應(yīng)用于新藥研發(fā)的思路

生活質(zhì)量的提高，使得藥物的不良反應(yīng)事件受到越來(lái)越多的關(guān)注，而高通量篩選藥物的同時(shí)，對(duì)藥物進(jìn)行有效的毒理學(xué)研究，選擇毒性較小的藥物進(jìn)行研究可以減少后期藥物研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，縮短藥物投入應(yīng)用的周期。 根據(jù)報(bào)告顯示[44-45]，40% ～80%的藥物由于安全問(wèn)題停止了研發(fā)，如果在藥物開(kāi)發(fā)前就對(duì)藥物的毒性進(jìn)行系統(tǒng)有效的檢測(cè)，這也能在很大程度上降低研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。 不幸的是進(jìn)入了臨床的藥物依然有不良反應(yīng)事件的發(fā)生，而臨床前的毒性檢測(cè)結(jié)果表明特異性良好(＞80%)，這顯示了臨床前毒性檢測(cè)的假陰性以及低靈敏度，也意味著在后續(xù)使用時(shí)將對(duì)人類(lèi)的健康和經(jīng)濟(jì)方面造成很大的損失[5]。 在新藥的研發(fā)中，Velozo-Sá 等[46]用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了4 種新釕化合物([Ru(N-S)(dppm)2]PF6 (1)，[Ru(N-S)(dppe)2]PF6 (2)，[Ru(N-S)2(dppp)] (3)和[Ru(N-S)2(PPh3)2](4))對(duì)乳腺癌的治療作用，發(fā)現(xiàn)濃度0.0375 ～0.075 μmol/L 化合物(1)或0.125 ～0.21 μmol/L化合物(2)對(duì)三陰性MDA-Mb-231 細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)具有明顯細(xì)胞毒作用，而采用0.5 ～100 mg/L的化合物(1)或(2)對(duì)Hacat 細(xì)胞(人類(lèi)永生化表皮細(xì)胞，非癌細(xì)胞)卻無(wú)毒性作用，后續(xù)采用了斑馬魚(yú)對(duì)化合物(1)和(2)進(jìn)行體內(nèi)毒理學(xué)評(píng)估(濃度分別為可達(dá)到的最高濃度88.8 μmol/L 和86.6 μmol/L)，未發(fā)現(xiàn)在胚胎和幼體發(fā)育期間有胚胎致死毒性或者其他毒性作用，表明了該化合物可能成為更有效，更安全的三陰性乳腺癌治療藥物新原型。 在新藥的研發(fā)時(shí)應(yīng)用斑馬魚(yú)進(jìn)行了相應(yīng)毒理學(xué)研究，驗(yàn)證了Velozo-Sá 等[46]所研發(fā)的新藥的有效性及安全性，更加能夠預(yù)見(jiàn)該藥物的應(yīng)用前景，這也可以作為斑馬魚(yú)應(yīng)用及新藥研發(fā)的一種思路。

4 展望

斑馬魚(yú)作為一種相對(duì)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物比較低等的動(dòng)物，可以替代嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，符合動(dòng)物福利的“3R(減少，替代和優(yōu)化)”理論；并且斑馬魚(yú)體積小，數(shù)量大，具有高通量篩選所需要的特點(diǎn)，相比嚙齒類(lèi)動(dòng)物低通量和/或近親繁殖，顯得更有優(yōu)勢(shì)。 斑馬魚(yú)胚胎的體外養(yǎng)殖，可作為體內(nèi)(哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn))和體外(細(xì)胞實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充，斑馬魚(yú)胚胎的光學(xué)透明性還使得實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行無(wú)創(chuàng)的連續(xù)觀察，獲取長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)的發(fā)育數(shù)據(jù)。 這些數(shù)據(jù)可為后期采用哺乳類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)提供依據(jù)，達(dá)到減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量的結(jié)果。 相比較于嚙齒類(lèi)，斑馬魚(yú)沒(méi)有那么的貼近于人類(lèi)，但是有時(shí)經(jīng)濟(jì)、易于操作比起貼和影響更大。 斑馬魚(yú)易于養(yǎng)殖，給藥方便，給藥量小，經(jīng)濟(jì)方便，這是斑馬魚(yú)的又一優(yōu)勢(shì)。斑馬魚(yú)的行為、外觀、病理等觀察以及實(shí)驗(yàn)操作等方面近年來(lái)得到快速發(fā)展，這也進(jìn)一步推動(dòng)了斑馬魚(yú)的應(yīng)用。 在高通量發(fā)現(xiàn)藥物的同時(shí)，可以對(duì)于藥物的毒性等進(jìn)行同步檢測(cè)，提前了解藥物的治療窗，應(yīng)用前景等，使得后期可以少走許多彎路，減少大量的經(jīng)濟(jì)損失。 因此，模式生物斑馬魚(yú)在藥物研究尤其是藥物毒性研究中的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。