胡盼 劉瑩 咸蕾 王鑫森 李佳睿

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

肝癌在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位〔1〕。盡管針對肝癌已有諸多治療措施，但由于大多數(shù)患者診斷延遲，發(fā)現(xiàn)時(shí)已達(dá)中晚期，導(dǎo)致肝癌患者治療后的預(yù)后較差，而根本原因即是腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移〔2〕。目前所能發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移灶大多數(shù)是通過計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)或正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET-CT)等影像檢測手段，但此時(shí)往往進(jìn)入了腫瘤晚期。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指由原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶通過血管侵犯而侵入癌癥患者外周血液中的腫瘤細(xì)胞〔3〕。早在1869年，Ashworth就在1例乳腺癌患者尸檢過程中發(fā)現(xiàn)了外周血中存在腫瘤細(xì)胞，隨著近年來分子生物學(xué)及檢測技術(shù)的發(fā)展，CTCs成為腫瘤早期轉(zhuǎn)移及治療術(shù)后復(fù)發(fā)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)〔4,5〕。已知，CTCs在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)及預(yù)后的預(yù)測中起著重要作用，但其在肝癌中的研究應(yīng)用還遠(yuǎn)不及這些腫瘤類型。本文著重探討肝癌CTCs的檢測及其對肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的預(yù)測作用。

1 CTCs的富集

對于CTCs來說，從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的釋放率尚未得知，已有實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻鳌?〕，數(shù)以百萬計(jì)的腫瘤細(xì)胞將會(huì)被釋放到血液循環(huán)中，但最終僅僅有數(shù)量相當(dāng)少的細(xì)胞可以成功地轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，逃避宿主免疫，保持休眠狀態(tài)，待錨定器官微環(huán)境適合時(shí)侵入，形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移病灶。究其原因〔7〕，首先，大量的血細(xì)胞及血流造成的剪切力會(huì)顯著減少CTCs的數(shù)量；其次，宿主的自身免疫系統(tǒng)也會(huì)檢測到一部分腫瘤細(xì)胞，并將其清除；最后，腫瘤細(xì)胞若在血流中存活，還必須逃避失巢凋亡的過程。綜上，外周血液中CTCs的數(shù)量十分有限，通常每106～107個(gè)血細(xì)胞中，只能找到一個(gè)CTCs。因此，CTCs富集技術(shù)的靈敏度和特異性也是成功檢測CTCs的關(guān)鍵。CTCs的富集策略可按照依賴其物理特性和生物特性分為兩大類，前者主要是根據(jù)CTCs的密度、體積、形狀等有別于其他血液細(xì)胞的特點(diǎn)而將其分離，后者主要是根據(jù)CTCs的表面存在諸多特異性的抗原，利用抗原-抗體反應(yīng)將其富集。

1.1密度梯度離心法 此方法是根據(jù)各種細(xì)胞在血液中的密度存在差異，通過離心的方法，將CTCs濾出。通過離心，紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞被分離至不同層面，腫瘤細(xì)胞位于最上層。目前常用的細(xì)胞密度梯度介質(zhì)為Ficoll和Onco Quick，有研究報(bào)道〔8〕，后者較前者具有更高的靈敏度。密度梯度離心法具有便捷、廉價(jià)、易操作，且不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，但其靈敏度較低，容易摻雜其他細(xì)胞，也容易造成CTCs的丟失，形成假陰性的結(jié)果，因此在實(shí)際應(yīng)用過程中，此方法常常作為檢測CTCs的前期工作基礎(chǔ)。

1.2濾過分離法 濾過法以CTCs的直徑大于其他血液細(xì)胞為依據(jù)，而實(shí)現(xiàn)CTCs的富集。Vona等〔9〕發(fā)明了上皮腫瘤細(xì)胞大小分離(ISET)方法，通過聚碳酸酯膜來過濾血液，使得CTCs與血液中的其他細(xì)胞分離。該種方法與密度梯度離心法類似，因此只作為前期步驟。

1.3免疫磁珠分離法 免疫磁珠分離法的基本原理為：將細(xì)胞表面相關(guān)抗原的抗體包被于具有順磁性的磁珠表面，這樣磁珠就會(huì)通過“磁珠/抗體-抗原/細(xì)胞”與細(xì)胞結(jié)合，外加強(qiáng)大磁場，目標(biāo)細(xì)胞就會(huì)與其他細(xì)胞分離?；诖嗽?，免疫磁珠分離法可以分為陽性分離法和陰性分離法。陽性分離法是將磁珠與CTCs表面抗原結(jié)合而直接分離CTCs的過程，而陰性分離法是將磁珠與血液細(xì)胞表面抗原結(jié)合而間接分離CTCs的過程，例如白細(xì)胞表面的特異性CD45抗體。陽性分離法具有代表性的方法被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床的Cell Search系統(tǒng)，Cell Search系統(tǒng)檢測的原理是基于大部分實(shí)體腫瘤細(xì)胞表面均表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)抗原，以此為靶點(diǎn)進(jìn)行富集CTCs〔10～13〕。肝癌雖然為上皮起源的腫瘤，但由于其向遠(yuǎn)處侵襲過程中會(huì)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，相應(yīng)的上皮細(xì)胞表面抗原也會(huì)向間質(zhì)細(xì)胞表面抗原轉(zhuǎn)化，因此肝癌細(xì)胞表面的上皮細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM表達(dá)水平相對較低〔14,15〕，該系統(tǒng)并不適用于肝細(xì)胞肝癌CTCs的監(jiān)測。Xu等〔16〕利用去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體來包裹磁珠，成功地從85例肝細(xì)胞癌患者中檢測出69名CTCs陽性患者，而在健康體檢者、良性肝臟腫瘤以及非肝細(xì)胞性肝癌患者中未檢測出CTCs。

1.4Can Patrol系統(tǒng) 最近，由我國自主開發(fā)的Can Patrol系統(tǒng)檢測肝細(xì)胞肝癌患者CTCs彌補(bǔ)了肝細(xì)胞肝癌研究領(lǐng)域的不足，該系統(tǒng)通過有機(jī)結(jié)合納米技術(shù)和多重RNA原位分析(RNA-ISH)技術(shù)，對CTC的分離不依賴于特定生物標(biāo)志物，大大提高了CTCs的回收率〔17〕。此外，與Cell research為代表的一代CTCs富集技術(shù)相比，Can Patrol系統(tǒng)不僅克服了Cell research技術(shù)只能分離獲得某一特定表型CTCs的缺陷，同時(shí)完全實(shí)現(xiàn)了對所有腫瘤表型CTCs的分離與鑒定〔18,19〕。

2 CTCs的識別

2.1形態(tài)分析與免疫組化 Cell Search系統(tǒng)將≥4 μm、DAPI+、角化蛋白(pan-keratin)+及CD45-的細(xì)胞判定為CTCs。Nam等〔20〕應(yīng)用細(xì)胞團(tuán)塊聯(lián)合多重免疫組化的方法，檢測了肌酸激酶(CK)、EpCAM、上皮細(xì)胞膜抗原(EMA)、重組人細(xì)胞角蛋白(CK)18、肝細(xì)胞單克隆抗體(HepPar)-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Glypican)-3及甲胎蛋白(AFP)，29例肝癌患者檢出率為48.3%，但是CK、EpCAM、Gypican3及AFP陽性的CTCs大部分存在于具有上皮細(xì)胞特征的肝癌細(xì)胞系中，對于發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞，可能會(huì)有遺漏。由于肝癌在侵襲過程中的異質(zhì)性，很難確定肝癌CTCs的特異性標(biāo)志物，因此，這也是此種方法的局限性所在。

2.2特異性核酸分析法 特異性核酸分析法并不是直接找到腫瘤細(xì)胞，而是通過在外周血中找出腫瘤細(xì)胞的特異性核酸，而間接證實(shí)CTCs的存在。因此，核酸表達(dá)的特異性直接反映了此方法的可靠性。因?yàn)楦伟┘?xì)胞與正常的上皮細(xì)胞有著相同的EpCAM，所以，大大降低了依賴于EpCAM分離CTCs的特異性，Jin等〔21〕通過在EpCAM免疫磁珠技術(shù)分選后的CTCs中檢測AFP mRNA的水平，提高了CTCs檢測的靈敏性及特異性。但是，由于血流中存在游離的腫瘤細(xì)胞DNA，此種方法很有可能形成假陽性的結(jié)果。

3 CTCs與肝癌

3.1CTCs與肝癌的治療 肝癌的治療手段頗多，手術(shù)切除、肝移植、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)、射頻消融術(shù)(RFA)、微波消融術(shù)(MWA)、放療等。Fang等〔22〕利用EpCAM免疫磁珠法檢測TACE圍術(shù)期患者外周血及右心房血中CTCs的數(shù)量，結(jié)果表明兩組患者TACE術(shù)前與術(shù)后相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而右心房中的CTCs要多于外周血。Sun等〔23〕通過檢測123名行手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌患者術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月的CTCs發(fā)現(xiàn)，術(shù)前7.5 ml血液中CTCs≥2個(gè)的患者要比CTCs<2個(gè)的患者復(fù)發(fā)早，并且CTCs≥2個(gè)是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子。

3.2CTCs與肝癌的預(yù)后 血行轉(zhuǎn)移是肝癌常見的轉(zhuǎn)移形式，因此肝癌患者血液中的CTCs與其預(yù)后有直接關(guān)系。CTCs與患者的總生存期、無進(jìn)展生存期、腫瘤分期等相關(guān)聯(lián)。Schulze等〔24〕發(fā)現(xiàn)，EpCAM+的CTCs陽性患者總生存期(OS)較CTCs陰性患者短，且與巴塞羅那(BCLC)分期呈正相關(guān)，提示CTCs陽性影響肝癌患者的預(yù)后。Nel等〔25〕通過對行選擇性內(nèi)放射治療(SIRT)的肝癌患者CTCs進(jìn)行檢測，報(bào)道胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-1 mRNA的水平與進(jìn)展時(shí)間(TTP)相關(guān)，認(rèn)為CTCs可以作為肝癌患者個(gè)體化治療的新型分子標(biāo)志物。Chen等〔26〕回顧分析了195位肝細(xì)胞癌患者的CTCs水平及分型得出結(jié)論，總CTCs數(shù)量與BCLC分期、轉(zhuǎn)移及血清AFP水平相關(guān)，并且復(fù)發(fā)的患者含有更高混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs，表明CTCs的數(shù)量和EMT的分型與肝癌的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。

4 總結(jié)與展望

肝癌的轉(zhuǎn)移起始于原發(fā)灶內(nèi)的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到血液中，隨后等待時(shí)機(jī)，侵襲遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移。隨著科學(xué)的發(fā)展，釋放入血的CTCs已經(jīng)可以被有效富集和檢測，但由于肝癌的異質(zhì)性及在轉(zhuǎn)移過程中EMT的發(fā)生，導(dǎo)致肝癌CTCs的檢測方法尚未形成共識。而由于檢測方法不一，致使各位學(xué)者對CTCs在肝癌的治療及預(yù)后方面的看法也有少許出入。因此肝癌CTCs檢測技術(shù)的改進(jìn)和完善及如何將其應(yīng)用于臨床實(shí)際工作中，將仍然是未來的熱點(diǎn)話題。希望基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究者能夠更加深入的探索CTCs的相關(guān)知識，并最終改善患者預(yù)后，為肝癌的診治提供新方法、新策略。