張瑋瑋 楊慧霞 薛屏

（1. 省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，銀川 750021）

隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類對能源的需求量不斷上升，以當(dāng)前的能源消費(fèi)速度預(yù)計到2050 年世界石油儲量將消耗殆盡［1］。另外，大量化石燃料消耗帶來的溫室效應(yīng)、大氣污染、酸雨、臭氧層空洞等環(huán)境問題也成為人類亟待解決的問題。因此，引發(fā)了全球?qū)稍偕途G色可持續(xù)生物燃料生產(chǎn)的研究熱潮。生其能滿足當(dāng)前和未來燃料需求的原料，由生物質(zhì)生成的生物燃料包括生物柴油、生物乙醇、生物氫和生物甲烷。其中，生物柴油生成轉(zhuǎn)化的脂肪酸甲酯（Fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME）無毒、可再生及生物降解，與石化柴油的理化性質(zhì)相似［2］。同時，與傳統(tǒng)燃料相比，生物柴油能量密度高、潤滑性能好、運(yùn)輸儲存安全、且含氧量高，燃燒更充分，CO2、CO、硫化物和顆粒物質(zhì)的排放量低［3］，是一種優(yōu)質(zhì)的綠色替代燃料。

目前，用于生物柴油生產(chǎn)的可再生原料分為3種類型：食用油、非食用油和廢棄油脂。食用油如大豆油、菜籽油和棕櫚油等，作為生物柴油原料，生產(chǎn)成本高，與糧食產(chǎn)業(yè)競爭，容易導(dǎo)致食品供應(yīng)和需求的不平衡［4］。特別是對于人口密度高的東亞國家可食用油脂供應(yīng)緊張，不適合以大量食用油做原料生產(chǎn)生物柴油。而非食用油，廢棄油脂和微藻油廉價易得、可以解決食用油衍生的生物柴油生產(chǎn)問題，是目前主要的可持續(xù)性替代原料［5］。

然而，非食用油和廢棄油脂具有高含量的游離脂肪酸（FFA）［6］，可以與堿發(fā)生皂化反應(yīng)，不能直接通過傳統(tǒng)的堿催化酯交換路線用于生產(chǎn)生物柴油。脂肪酶能夠催化酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)，可以使用相對便宜的高FFA 和水含量的這類油品作為生產(chǎn)生物柴油的原料油［7］。因此，與傳統(tǒng)化學(xué)催化過程相比，脂肪酶催化制備生物柴油具有低能耗、后處理成本低、原料更廣泛的特點，表現(xiàn)出更好的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢［8-9］。但是，在大多數(shù)情況下，不可再生催化的高成本限制了酶催化過程的工業(yè)化應(yīng)用。

酶的固定化技術(shù)可以有效地提高酶的催化性能和操作穩(wěn)定性，并降低其成本，是目前廣泛使用的技術(shù)［9］。此外，固定化脂肪酶比游離脂肪酶更利于產(chǎn)品的分離純化，在pH 耐受性，底物選擇性，熱穩(wěn)定性和回收使用性等方面表現(xiàn)出優(yōu)越的性能［10-11］。

目前，使用各種載體固定化的酶在各個領(lǐng)域均有重要的應(yīng)用，包括生物傳感器、生物燃料生產(chǎn)和藥物釋放等［10］。然而，基于傳統(tǒng)固相載體的固定化酶也存在一些不可避免的技術(shù)問題，如酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，空間位阻和低擴(kuò)散速率［12］。為了解決這些問題，各種納米材料被廣泛應(yīng)用于酶的固定化。納米材料高的比表面積提高了酶的負(fù)載率和傳質(zhì)效率，作為固定化載體具有顯著優(yōu)勢［13］。本文回顧和討論近幾年酶固定技術(shù)的研究進(jìn)展，并闡述了納米載體的結(jié)構(gòu)及固定化方法的選擇對脂肪酶在催化生物柴油反應(yīng)中的活性差異的影響，旨在為開發(fā)高效的固定化脂肪酶過程中載體和方法的選擇，以及工業(yè)化酶促生產(chǎn)生物柴油體系的建立和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 納米載體固定化脂肪酶研究

脂肪酶廣泛存在于真菌、細(xì)菌、動物和植物中［14］，通常在水/油界面上催化甘油三酯水解成甘油和游離脂肪酸。除了水解反應(yīng)，脂肪酶還可以催化酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)［15］。因此，在化妝品、有機(jī)合成、洗滌劑、食品、制藥工業(yè)及生物柴油領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用［15-16］。目前常用于脂肪酶固定化的納米材料主要可分為3 類：納米粒子、碳納米管和納米靜電紡絲。

1.1 納米粒子載體

1.1.1 非磁性納米粒子 納米顆粒相對于其他無機(jī)材料的最大優(yōu)點是它們能夠顯著降低質(zhì)量擴(kuò)散限制。同時，酶分子附著在高比表面積的無孔顆粒表面，提高了催化活性位點與底物的結(jié)合效率，從而表現(xiàn)出更高的酶活保留［17］。酶分子固定化在非磁性納米顆粒上可以很好地分散在反應(yīng)液中，利于反應(yīng)的傳質(zhì)效率，但小粒徑的納米顆粒需要長時間的高速離心才能實現(xiàn)固定化酶的重復(fù)使用，因此也限制了固定化酶的工業(yè)化應(yīng)用。目前，粒徑1-100 nm 的納米粒子在固定化脂肪酶領(lǐng)域已有普遍的應(yīng)用［18］，常見的非磁性納米載體包括氧化鋯，二氧化硅，聚苯乙烯，殼聚糖和聚乳酸（Polylactic acid，PLA）等。

一般情況下，脂肪酶分子中存在覆蓋活性中心的特殊疏水性多肽鏈結(jié)構(gòu)-“蓋子”，使得脂肪酶在親水性無機(jī)載體表面上表現(xiàn)出較差的結(jié)合能力［19］。Chen 等［20］將洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，PCL）共價固定化在修飾了各種羧酸（戊酸、辛酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和1，10-癸二羧酸）的氧化鋯（ZrO2）納米顆粒上。由于硬脂酸疏水性長鏈的界面活化作用［19］，PCL 固定化在硬脂酸修飾的ZrO2載體上表現(xiàn)出更高的活性和對映選擇性，初始活性分別比未修飾的ZrO2-PCL 和游離脂肪酶高10.5 和16.6 倍。類似的，Mileti? 等［21］通過吸附法將南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B，CAL-B）固定在聚苯乙烯納米顆粒上，由于載體的疏水性作用其活性比廣泛應(yīng)用的商品化固定化酶Novozyme 435 高1.16 倍，比游離酶高1.81 倍。在另一項研究中，米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor mieheilipase，RML）被共價固定在由辛基三乙氧基硅烷（Octyltriethoxysilane，OTES，界面活化作用）和3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（Glycidoxypro pyltrimethoxylsilane，GPTMS，與酶共價結(jié)合位點）修飾的二氧化硅納米粒子上［22］。通過調(diào)節(jié)GPTMS /OTES 的比例改變載體表面疏水性辛基和親水性環(huán)氧基團(tuán)的量，發(fā)現(xiàn)RML 在辛基官能化的載體上的活性比游離酶高約1.5-2 倍。而這種活性提高隨著載體上環(huán)氧基團(tuán)的增加而降低，證明載體的疏水性質(zhì)對脂肪酶分子與載體的結(jié)合至關(guān)重要。

1.1.2 磁性納米粒子 在催化反應(yīng)之后，能否有效地從反應(yīng)液中分離出來，是固定化酶應(yīng)用過程中必須解決的關(guān)鍵問題之一。磁性納米粒子（Magnetic nanoparticle，MNP）作為固定化載體的使用就是一個有效的解決方案。MNP 比表面積大、表面羥基豐度高，易于進(jìn)行表面修飾以及與酶分子的結(jié)合（共價）［23］。同時，納米級磁性粒子具有超順磁性的獨特性質(zhì)，可以使用外部磁場簡單地從生物催化體系中分離，機(jī)械穩(wěn)定性高、孔隙率低，利于降低反應(yīng)中的傳質(zhì)阻力，提高固定化酶的重復(fù)使用性。

磁性氧化鐵由于其價廉易得、低毒性和生物相容性是目前主要用作載體磁性納米顆粒［23］。Mehrasbi 等［24］將CAL-B 共價固定化在GPTMS 功能化修飾的磁性納米顆粒上，并用于催化廢烹飪油制備生物柴油，固定化酶回收使用6 次后仍能保持100%的初始活性。Lee 等［25］用十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）作疏水性功能基修飾磁性納米粒子（尺寸8-12 nm），用于粗豬胰脂肪酶（Porcine pancreaslipase，PPL）的固定化。與游離PPL 相比，固定化PPL 的活性提高了1.42 倍，且熱穩(wěn)定性有明顯提高。Lei等［26］通過自由基聚合將聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯）（Glycidyl methacrylate，GMA）接枝到Fe3O4/ SiOx 的表面上，用于皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase，CRL）的固定化。功能化的超順磁性納米粒子直徑為100 nm，并且顯示出更高的飽和磁化強(qiáng)度（8.3 kA /m）。固定化的CRL表現(xiàn)出更高的pH 耐受性和熱穩(wěn)定性，并且在重復(fù)使用六次后保持初始活性的83%。Zhang 等［27］以3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）修飾的Fe3O4為載體與表面活性劑活化的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶聚集體（Thermomyces lanuginosuslipase，cross-linked enzyme aggregates，TLL CLEAs）交聯(lián)，并將其應(yīng)用在制備生物柴油中。修飾的磁性納米粒子的加入，提高了固定化酶的機(jī)械穩(wěn)定性，并且降低了CLEAs 中的傳質(zhì)阻力，在生物柴油反應(yīng)中得到88%的產(chǎn)率，且回收10 次以后活性沒有明顯的降低。Li 等［28］將三聚氰胺-戊二醛樹枝狀聚合物接枝在APTES 修飾的磁性納米載體上，用于固定化洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶（Burkholderia cepacialipase，BCL）。樹枝狀聚合物的修飾可以有效提高酶在納米載體上的負(fù)載率。結(jié)合生物印跡預(yù)處理，將1-苯基乙醇的拆分反應(yīng)時間縮短至20 min，達(dá)到98.8%的ees。Xing 等［29］用表面氨基功能化磁性納米粒子（APTES-Fe3O4）制備了磁性的南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）的交聯(lián)酶聚集體，并用于拆分1-苯基乙醇。在最佳條件下，達(dá)到50%的轉(zhuǎn)化率，eep＞99%，ees＞99%，對映體比率（E）＞1000 的選擇性。同時，重復(fù)使用10 次以后活性和選擇性均沒有明顯的降低。

1.2 碳納米管載體

碳納米管，包括單壁納米管（Single-walled carbon nanotube，SWNT）和多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotube，MWNT），是近年來越來越廣泛使用的一種新型載體材料。基于石墨片的碳納米管具有獨特的有序無孔結(jié)構(gòu)、表面積大、生物相容性好、易于功能化修飾，同時表現(xiàn)出優(yōu)異的耐熱性，耐化學(xué)性和機(jī)械穩(wěn)定性［30］。與其他材料不同，碳納米管可以增強(qiáng)底物和固定化酶之間的電子轉(zhuǎn)移。因此，最常用于固定氧化還原酶，并應(yīng)用于生物傳感器中。

目前也有一些報道研究了碳納米管對脂肪酶的固定化［31］。Shah 等［32］通過物理吸附法將CRL 固定在MWCT 上，酶活保留達(dá)到97%，并且在正己烷和離子液體［Bmim］PF6中的酯交換初始速率分別提高了2.2 倍和14 倍。Mohamad 等［33］報道了一種簡單的吸附方法，將CRL 固定在羧基功能化的MWNTs（F-MWNTs）上。MWNT 表面上帶電荷的羧基部分可以與CRL 上的其他極性部分（NH2和OH）結(jié)合，與游離酶相比，固定化CRL 在MWNT 上的活性和熱穩(wěn)定性提高了兩倍。Li 等［34］將BCL 吸附在CNTs 上，再利用蛋白和無機(jī)金屬鹽組裝的方法制備了具有多級花狀的有機(jī)-無機(jī)雜化納米結(jié)構(gòu)實現(xiàn)酶的固定化。CNTs 的加入可以提高酶的負(fù)載率和穩(wěn)定性，同時降低了納米花致密結(jié)構(gòu)中的傳質(zhì)阻力。復(fù)合的Cu3（PO4）2/ CNT / BCL 固定化酶的酯化反應(yīng)活性比游離BCL 和不加CNTs 的Cu3（PO4）2/BCL 分別高出68 倍和51 倍。且在1-苯基乙醇的拆分反應(yīng)中，10 min 可以達(dá)到98%的ees。

1.3 納米靜電紡絲載體

納米靜電紡絲纖維尺寸均一、組成多樣，具有高孔隙率和比表面積，保證酶的高負(fù)載率，降低傳質(zhì)阻力。同時，有優(yōu)異的生物相容性、無毒性、生物降解性、高機(jī)械強(qiáng)度和親水性，作為酶固定化載體的應(yīng)用有巨大潛力［35］。相比于其他載體的巨大優(yōu)勢在于，各種合成聚合物如聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚氨酯，以及生物聚合物如甲殼質(zhì)、殼聚糖、藻酸鹽和纖維素，均可用于制備靜電紡絲載體，可以針對每種酶分子的特性選擇相應(yīng)合適的載體及功能化修飾。并且固定化方法的選擇多樣，酶分子可以通過吸附作用或共價結(jié)合在載體表面，或者在制備載體的過程中包埋在載體內(nèi)［36］。

Huang 等［37］報道了一例共價結(jié)合在電紡纖維素納米纖維膜上的固定化CRL，在最佳條件下活性達(dá)到29.6 U / g。Song 等［38］考察了BCL 包埋在聚己內(nèi)酯（Polycarprolacone，PCL）納米纖維中在水中的水解活性和非水介質(zhì)中的酯交換活性，結(jié)果顯示BCL固定化在PCL 載體上的水解活性明顯高于酯交換活性。Weiser 等［39］使用PVA 納米纖維通過包埋固定化五種不同類型的脂肪酶，并用于催化?；磻?yīng)動力學(xué)拆分外消旋仲醇。由于聚合物納米纖維的結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定酶分子的活性構(gòu)象，經(jīng)過固定化的5 種酶活性均有提高。Soti 等［40］分別使用PVA 和PLA 納米纖維膜對BCL 和CAL-B 進(jìn)行吸附固定，用于1-苯基乙醇和1-苯基乙酸酯的動力學(xué)拆分。酶在聚合物載體上的均勻分散和納米纖維大的比表面積使得固定化酶的活性顯著提高。其中，固定在PLA 納米纖維膜上的脂肪酶表現(xiàn)出更高的活性、對映選擇性和機(jī)械穩(wěn)定性。Dwivedee 等［41］通過苯胺的氧化聚合合成了聚苯胺納米纖維（Polyaniline nanofiber，PANF），并將熒光假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas fluorescenslipase，PFL）物理吸附在PANF 上。固定化PFL 的活性與游離酶高8 倍，且動力學(xué)常數(shù)（Km）降低了5 倍，表明納米結(jié)構(gòu)的固定化酶對底物表現(xiàn)出更高的親和力。

2 納米載體固定化脂肪酶在生物柴油中的應(yīng)用

通過各種納米載體固定化的脂肪酶在酶活保留、穩(wěn)定性和重復(fù)使用性上均有不同程度的改善，可以降低酶的使用成本，提高酶促生物柴油過程的經(jīng)濟(jì)性。Raita 等［42］研究了固定化在磁性納米粒子上的TLL 在棕櫚油制備生物柴油的反應(yīng)活性，在最佳條件下反應(yīng)24 h 后的產(chǎn)量為97.2%。Zhang 等［43］結(jié)合界面活化預(yù)處理和磁性納米載體，制備了表面活性劑活化的磁性RML 交聯(lián)酶聚集體，在有機(jī)溶劑中的酯交換活性比游離酶提高了20 倍。同時，在生物柴油轉(zhuǎn)化實驗中得到了的93%的產(chǎn)率，在5 次回收實驗后保留了超過84%的初始活性。Babaki 等［44］考察了GPTMS 修飾的中孔SBA-15 納米顆粒分別對CALB、TLL、RML 這3 種脂肪酶的共價固定化，用于菜籽油的甲醇分解酶促生產(chǎn)生物柴油反應(yīng)。其中，SBA-RML 和SBA-TLL 的生物柴油轉(zhuǎn)化率可以分別達(dá)到95%和98%。同時，經(jīng)過修飾納米顆粒的固定化，酶的熱穩(wěn)定性和甲醇耐受性均有提高。Cazaban等［45］分別使用原位包埋在仿生二氧化硅納米粒子中和共價偶聯(lián)在OTES 和3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷修飾的二氧化硅納米粒子上，兩種方法固定了TLL，并用于生物柴油反應(yīng)中。與商品化的固定化TLL 和原位包埋的TLL 相比，共價偶聯(lián)的固定化酶得到更高的生物柴油產(chǎn)率?？赡苁怯捎谠话襁^程中親水性聚合物PEI 的加入限制了甘油三酯在固定化酶中的擴(kuò)散，也增加了甘油在固定化酶表面的富集，而降低了原位包埋TLL 的酯交換活性。

能源安全、農(nóng)村發(fā)展和氣候變化等重大問題［46］促進(jìn)了生物柴油生產(chǎn)和應(yīng)用研究的快速發(fā)展。目前，原料油的成本仍然是制約生物柴油生產(chǎn)規(guī)模化發(fā)展的主要問題之一。在過去的20 年中，發(fā)展了基于不同原料油的不同代生物柴油。其中，第一代生物柴油主要以食用植物油為原料。2015 年，全球生物柴油產(chǎn)量的69%來自食用植物油［47］。如此高比例的食用原料的使用影響了食品供給平衡和油料價格，同時食用油的高成本也限制了生物柴油生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，基于非食用油脂（包括非食用植物油，如麻風(fēng)樹果油、桐梓油、蓖麻油等及廢棄油脂，包括餐飲廢油、動物油脂等）的第二代生物柴油和微生物/微藻油的第三代生物柴油迅速發(fā)展起來。

通過餐飲廢油的酶促酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油，不僅能降低生物柴油的原料成本，餐飲廢油也得到安全利用。同時也避免了餐飲廢油的環(huán)境污染問題，是解決環(huán)境污染和能源需求問題的有效途徑。Fan等［48］將RML 固定在聚乙二胺（PAMAM）修飾的磁性多壁碳納米管（MWCNT）上。固定化的RML顯示出比游離酶高27 倍的酯化活性，且在最佳條件下，催化廢植物油制備生物柴油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%，在10 個循環(huán)后轉(zhuǎn)化率仍無顯著降低。Zhang 等［49］將從Candidasp.99-125 分離的脂肪酶共價固定化在環(huán)氧氯丙烷修飾的MNP 上，用于酸化餐飲廢油的生物柴油轉(zhuǎn)化。其中，酸性廢油中含有高達(dá)96.23%的FFA、1.23%的甘油二酯和2.53%的甘油三酯。在甲醇∶FFA 摩爾比為1∶10，40℃的最佳反應(yīng)條件下，生物柴油產(chǎn)率為97.11%。Karimi［50］合成了超順磁性氧化鐵納米顆粒，經(jīng)硅烷修飾后用于共價固定化BCL。固定化酶在餐廚廢油的生物柴油轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，35℃反應(yīng)35 h 后轉(zhuǎn)化率達(dá)到91%。

微生物/微藻與油料作物相比，具有單位面積產(chǎn)率高、繁殖速度快、生產(chǎn)周期短的優(yōu)勢，同時油脂脂肪酸組成與植物油類似，又不與油料作物競爭耕地面積，因此是潛在的原料油來源。但是，微藻油中的游離脂肪酸含量高（取決于儲存條件，有時可高達(dá)70 wt%），不能用于堿催化的酯交換反應(yīng)［51］。Tran 等［52］將長鏈烷基修飾的Fe3O4-SiO2用于固定化從菌株Burkholderiasp. C20 分離純化的粗脂肪酶，并用于從小球藻Chlorella vulgarisESP-31 一步提取/酯交換制備生物柴油的過程。同時，研究了含水量、脂質(zhì)含量、溶劑添加量和甲醇/油比對微藻生物質(zhì)直接酯交換反應(yīng)的影響。疏水性磁性納米載體固定化的脂肪酶在高水含量的微藻生物質(zhì)（水含量高達(dá)86%-91%）中表現(xiàn)出較高的催化活性和甲醇耐受性。在最佳條件下，生物柴油轉(zhuǎn)化率超過90%。Picó 等［53］以氨基功能化的MNP 為載體制備了CALB 的磁性交聯(lián)酶聚集體，并用于小球藻油脂的生物柴油轉(zhuǎn)化，酸催化過程在100℃下反應(yīng)1 h，獲得80.2%±4.4%的生物柴油轉(zhuǎn)化率。而CALB 的磁性交聯(lián)酶聚集體催化的反應(yīng)在溫和的反應(yīng)條件下，30℃反應(yīng)3 h，獲得了超過90%的生物柴油轉(zhuǎn)化率，并且連續(xù)回收使用10 次，可以保留90%的初始生物柴油轉(zhuǎn)化率。近年也有報道［54］將TLL 用戊二醛共價固定化在APTES 修飾的不同晶體結(jié)構(gòu)的納米沸石上，用于微藻油的生物柴油轉(zhuǎn)化反應(yīng)中。實驗表明，載體表面的功能化修飾提高了酶的負(fù)載率和穩(wěn)定性，并且與物理吸附固定化的TLL 相比表現(xiàn)出更高的生物柴油產(chǎn)率。

3 總結(jié)與展望

與傳統(tǒng)固相載體或游離酶相比，脂肪酶固定化在各種納米材料上，在負(fù)載率、酶活保留、傳質(zhì)效率、機(jī)械穩(wěn)定性以及可回收性等方面均表現(xiàn)出許多優(yōu)勢，在催化生物柴油轉(zhuǎn)化中也表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但仍需深入研究納米材料的工藝改進(jìn)和擴(kuò)大生產(chǎn)，以充分發(fā)揮其在工業(yè)水平上的應(yīng)用，協(xié)調(diào)固定化酶催化活性和制備成本及工藝，以便在工業(yè)水平實現(xiàn)酶促生物柴油生產(chǎn)過程的擴(kuò)大。納米固定化脂肪酶在填充床反應(yīng)器中的應(yīng)用可以降低攪拌剪切力對固定化酶活性的影響，提高固定化酶的重復(fù)使用性，也便于產(chǎn)物的分離純化，是實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的重要途徑之一。同時，通過復(fù)合納米載體的設(shè)計和構(gòu)建實現(xiàn)多種酶的共固定化，以便于實現(xiàn)固定化酶對復(fù)雜原料進(jìn)行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，也對促進(jìn)綠色可持續(xù)生物質(zhì)生產(chǎn)的發(fā)展具有重要意義。