張通，龍科藝，曹華杰，吳思佳，元躍，陳寧,3，范曉光,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(河南巨龍生物工程股份有限公司，河南 汝州，467500) 3(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津,300457)

L-茶氨酸是茶葉中特有的氨基酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)占其總游離氨基酸50%以上[1]。L-茶氨酸有許多有益的生理效果，能夠促進(jìn)人腦放松，提高注意力和促進(jìn)學(xué)習(xí)能力[2]。 在醫(yī)療保健方面，L-茶氨酸具有降低血壓、預(yù)防血管疾病、緩解壓力、保護(hù)神經(jīng)、減肥降脂和提高免疫系統(tǒng)能力等功效[3-9]。在食品方面，L-茶氨酸已被FDA列為安全的食品藥品添加劑，用于改良食品品質(zhì)、增強(qiáng)食品風(fēng)味[10]。

現(xiàn)有的L-茶氨酸的生產(chǎn)方法主要包括提取法、化學(xué)合成法和酶催化法。提取法是最天然的L-茶氨酸生產(chǎn)方法，但由于干茶葉中L-茶氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅占1%～2%，導(dǎo)致從茶葉或茶葉廢渣中提取L-茶氨酸提取量少、產(chǎn)品純度低，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)需求[11]。化學(xué)合成法是目前茶氨酸生產(chǎn)的主要途徑，是利用酯型或乙?；腖-谷氨酸和乙胺作為底物，通過控制反應(yīng)過程和反應(yīng)條件使L-谷氨酸和乙胺結(jié)合形成L-茶氨酸[12]，但由于合成產(chǎn)物易存在對(duì)映異構(gòu)體，導(dǎo)致分離困難、產(chǎn)品收率低。近來使用酶催化法生產(chǎn)L-茶氨酸引起了很多學(xué)者的關(guān)注，目前主要有4種不同的細(xì)菌來源的酶可作為理想的生物催化劑并顯示出不同的潛力。這4種細(xì)菌來源的酶，包括L-谷氨酰胺合成酶(L-glutamine synthetase, GS)[13]，γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶(γ-glutamylmethylamide, GMAS)[14]，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, GGT)[15]和L-谷氨酰胺酶[16]。上述4種細(xì)菌酶都被證實(shí)了有較高的催化L-茶氨酸合成的活性，但這些已被證實(shí)的酶的微生物來源十分有限，且酶催化法合成L-茶氨酸包括產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)和酶促反應(yīng)兩個(gè)過程，需要使用價(jià)格較高的谷氨酸/谷氨酰胺鹽和ATP為原料[17]，生產(chǎn)成本與提取法和化學(xué)法相比并無優(yōu)勢。

鑒于現(xiàn)有L-茶氨酸生產(chǎn)方法的不足，本研究通過構(gòu)建重組大腸桿菌高效表達(dá)來源于Methylovorusmays的γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶,并通過流加前體物乙胺發(fā)酵的方式直接發(fā)酵合成L-茶氨酸。根據(jù)L-茶氨酸的物化性質(zhì)擬定出合適的分離提取路線，從發(fā)酵液中獲得了合格的L-茶氨酸成品。整個(gè)生產(chǎn)工藝具有較好的經(jīng)濟(jì)可行性和工業(yè)應(yīng)用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所需菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 1，蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母粉 5，NaCl 2.5，瓊脂 25，pH 7.0；

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 25，酵母提取物 10，蛋白胨 15，NaCl 15，pH 7.2;

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母提取物10，蛋白胨15，KH2PO45，MgSO42，pH 7.2。

1.1.3 主要試劑

PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒:北京博大泰克生物基因有限責(zé)任公司；L-茶氨酸標(biāo)品:美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 目的基因擴(kuò)增

1.2.1 以DNA為模板的PCR

在PCR儀上根據(jù)引物和片段長度分別設(shè)定退火溫度(約低于理論退火溫度5 ℃)和延伸時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)使用Prime STAR酶作為DNA聚合酶，擴(kuò)增速率約為1 kb/min。PCR反應(yīng)條件：首先95 ℃預(yù)變性5 min，之后進(jìn)入如下循環(huán)：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸合適時(shí)間(根據(jù)片段長度)，完成最后一個(gè)循環(huán)后，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。其中驗(yàn)證體系進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，回收體系進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增PCR反應(yīng)液體系如表2所示。

表2 擴(kuò)增PCR反應(yīng)液體系Table 2 Composition of PCR reaction solution

1.2.2 重疊PCR

以T7-gmas基因整合為例。根據(jù)GenBank中E.coliW3110的yghX基因序列、T7啟動(dòng)子和Methylovorusmays的gmas序列，在Primer Premier 5.0中設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增上游同源臂、下游同源臂和中間整合片段。其中相連片段分別有約20 bp的重疊區(qū)域。PCR擴(kuò)增體系如表3所示。

表3 重疊PCR擴(kuò)增體系Table 3 Amplification system of overlap PCR

分別回收T7-gmas上、下游同源臂和整合片段PCR產(chǎn)物，以1∶1∶2的摩爾比進(jìn)行混合作為模板，通過重疊PCR，將上游、下游和中間整合片段3段片段連接起來。

1.3 CRISPR/Cas9基因整合方法

1.3.1 帶有擬敲除基因同源臂基因片段的擴(kuò)增

帶有擬敲除基因同源臂片段擴(kuò)增的方法參見1.2.1以DNA為模板的PCR和1.2.2重疊PCR。PCR擴(kuò)增完成后切膠回收片段。

1.3.2 整合基因替換擬敲除目的基因

將重疊片段和gRNA質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)入含有pRedCas9質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞感受態(tài)中，于32 ℃培養(yǎng)，待長出單菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，再消除pGRB和pRedCas9。

1.4L-茶氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法

從-80 ℃冰箱保菌管中刮1環(huán)菌種，均勻涂布于活化斜面，37 ℃培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接茄形瓶繼續(xù)培養(yǎng)12 h。取適量無菌水于茄形瓶中，將菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，pH值穩(wěn)定在7.0左右，溫度恒定在37 ℃，溶氧在20%～30%，培養(yǎng)6 h。按照15%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，開始發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制pH值穩(wěn)定在7.0左右，溫度維持在37 ℃，溶氧在25%～35%之當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完之后，流加800 g/L的葡萄糖溶液并維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度<2 g/L，發(fā)酵開始4 h時(shí)開始以30 mL/h的速率流加2 mol/L的乙胺溶液至發(fā)酵結(jié)束。

1.5L-茶氨酸的分離純化

根據(jù)L-茶氨酸的物化性質(zhì)制定了合理的產(chǎn)品分離提取工藝。具體流程為：微濾去除發(fā)酵液中的菌體，微濾膜的孔徑為0.1 μm，料液循環(huán)體積為0.2 L，過濾流速為0.5～10 L/h；超濾膜除蛋白質(zhì)和色素，超濾膜截留分子質(zhì)量600 Da；初步濃縮脫色，使用陽離子交換樹脂進(jìn)行濃縮脫色；藥用炭脫色，用量3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的活性炭，溫度60 ℃，攪拌混合時(shí)長25 min；二次濃縮，使用真空濃縮裝置，真空度-0.1 MPa，濃縮至飽和；冷乙醇析晶；重結(jié)晶，將結(jié)晶用去離子水溶解，然后重復(fù)濃縮至冷乙醇析晶的步驟；利用減壓烘干設(shè)備，烘干成品，成品含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)<5%。測定膜過濾處理前后溶液在600 nm下的吸收值，根據(jù)公式(1)即可求得菌體細(xì)胞截留率Ycell；測定膜過濾和脫色處理前后溶液在540 nm下的吸收值，根據(jù)公式(2)即可求得色素截留率Ypigment；根據(jù)考馬斯亮藍(lán)顯色方法測定可溶性蛋白質(zhì)含量，根據(jù)公式(3)可以求得蛋白截留率Yprotein：

(1)

(2)

(3)

1.6L-茶氨酸的檢測方法

發(fā)酵液預(yù)處理：取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心2 min，取上清液待測。

衍生處理：用移液器取200 μL衍生緩沖液加入到2 mL離心管中，取上述上清液10 μL加入反沖液中，再加入300 μL衍生劑溶液，充分混勻后，將反應(yīng)液置于65 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)1 h，取出加入定容緩沖液定容至1.2 mL，充分搖勻后過0.2 μm膜后進(jìn)行色譜分析[18]。

高效液相色譜檢測：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm，5-Micron)，流動(dòng)相為乙酸鈉緩沖液，50%乙腈，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm，采用二元梯度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 在大腸桿菌E. coli origin中單拷貝T7啟動(dòng)子控制的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas

以E.coliorigin基因組為模板，根據(jù)其yghX基因的上下游序列設(shè)計(jì)上游同源臂引物UP-yghX-S、UP-yghX-A和下游同源臂引物DN-yghX-S、DN-yghX-A，通過PCR擴(kuò)增其上下游同源臂片段。根據(jù)針對(duì)大腸桿菌優(yōu)化合成的gmas基因序列，設(shè)計(jì)引物gmas-S、gmas-A，通過PCR擴(kuò)增gmas基因片段，將啟動(dòng)子T7設(shè)計(jì)在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中。通過重疊PCR將上述片段整合為“上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂”的重疊片段。設(shè)計(jì)引物gRNA-yghX-S和gRNA-yghX-A擴(kuò)增包含靶序列的DNA片段，與線性化的pGRB載體重組后獲得重組的pGRB-yghX。將整合片段和pGRB-yghX電轉(zhuǎn)化至含有pREDCas9載體的E.coliorigin感受態(tài)細(xì)胞中，將電轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇培養(yǎng)的菌體涂布于含氨芐青霉素和奇霉素的LB平板上，32 ℃過夜培養(yǎng)后利用PCR驗(yàn)證陽性重組子，再消除用于基因編輯的pGRB-yghX。

圖1是T7-gmas整合片段的陽性菌株P(guān)CR驗(yàn)證的電泳圖。其中，上游同源臂的長度應(yīng)為648 bp，gmas基因片段長度應(yīng)為1 415 bp，下游同源臂的長度應(yīng)為595 bp，整合片段的總長應(yīng)為2 607 bp，PCR驗(yàn)證時(shí)，陽性菌PCR擴(kuò)增片段長度應(yīng)為2 607 bp，原菌PCR擴(kuò)增片段長度應(yīng)為1 765 bp。電泳圖證明該片段整合成功。將單拷貝T7-gmas基因的菌株命名為E.coligmas1。

圖1 yghX::T7-gmas的PCR驗(yàn)證圖Fig.1 PCR verification diagram of yghX::T7-gmas注：M：1kb Marker；1：上游同源臂；2：目的基因；3：下游同源臂；4：重疊片段；5：原菌PCR片段；6：目的菌PCR片段。圖2同。

2.2 在大腸桿菌E. coli origin中雙拷貝T7啟動(dòng)子控制的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas

以E.coliorigin基因組為模板，根據(jù)其yeeP基因的上下游序列設(shè)計(jì)上游同源臂引物UP-yeeP-S、UP-yeeP-A和下游同源臂引物DN-yeeP-S、DN-yeeP-A，通過PCR擴(kuò)增其上下游同源臂片段。根據(jù)針對(duì)大腸桿菌優(yōu)化合成的gmas基因序列，設(shè)計(jì)引物gmas-S、gmas-A，通過PCR擴(kuò)增gmas基因片段，將啟動(dòng)子T7設(shè)計(jì)在上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中。通過重疊PCR將上述片段整合為“上游同源臂-T7-gmas-下游同源臂”的重疊片段。設(shè)計(jì)引物gRNA-yeeP-S和gRNA-yeeP-A擴(kuò)增包含靶序列的DNA片段，與線性化的pGRB載體重組后獲得重組pGRB-yeeP。將整合片段和pGRB-yeeP電轉(zhuǎn)化至含有pREDCas9載體的E.coliorigin感受態(tài)細(xì)胞中，將電轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇培養(yǎng)的菌體涂布于含氨芐青霉素和奇霉素的LB平板上，32 ℃過夜培養(yǎng)后利用PCR驗(yàn)證陽性重組子，再消除用于基因編輯的pGRB-yeeP。

圖2是T7-gmas整合片段的陽性菌株P(guān)CR驗(yàn)證的電泳圖。其中，上游同源臂的長度應(yīng)為558 bp，gmas基因片段長度應(yīng)為1 415 bp，下游同源臂的長度應(yīng)為547 bp，整合片段的總長度應(yīng)為2 469 bp。PCR驗(yàn)證時(shí)，陽性菌PCR擴(kuò)增片段長度應(yīng)為2 469 bp，原菌PCR擴(kuò)增片段長度應(yīng)為1 396 bp。電泳圖證明該片段整合成功。將雙拷貝T7-gmas基因的菌株命名為E.coligmas2。

圖2 yeeP::T7-gmas的PCR驗(yàn)證圖Fig.2 PCR verification diagram of yeeP::T7-gmas

2.3E. coli gmas1和E. coli gmas2的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果比較

為對(duì)比2株菌生產(chǎn)L-茶氨酸的能力，對(duì)單拷貝E.coligmas1和雙拷貝E.coligmas2菌株進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，由于大腸桿菌能夠通過自身代謝產(chǎn)生L-谷氨酸和ATP，因此只需要在發(fā)酵過程中外源添加前體物乙胺即可獲得L-茶氨酸。結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，E.coligmas2菌株5 L發(fā)酵罐發(fā)酵L-茶氨酸產(chǎn)量為30.45 g/L，比E.coligmas1提高了22%左右，而菌體濃度E.coligmas2菌株比E.coligmas1降低了11%左右。在耗糖量方面，E.coligmas2菌株的耗糖量為150.97 g/L，而E.coligmas1菌株為124.17 g/L，兩者的糖酸轉(zhuǎn)化率均為20%左右。上述結(jié)果表明增加γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas的拷貝數(shù)雖然能夠提升L-茶氨酸的產(chǎn)量，但對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率影響不大，且過多的異源基因表達(dá)會(huì)加重菌體的生長負(fù)擔(dān)。后期可考慮通過進(jìn)一步強(qiáng)化葡萄糖到L-谷氨酸的代謝流量來提升糖酸轉(zhuǎn)化率，從而增加葡萄糖的利用率。

a-E. coli gmas1;b-E. coli gmas2圖3 5 L發(fā)酵罐中不同重組菌發(fā)酵L-茶氨酸的進(jìn)程曲線Fig.3 Fermentation process curve of L-theanine in 5 L-fermetor by different recombinant strain

2.4 從發(fā)酵液中分離提取L-茶氨酸產(chǎn)品

發(fā)酵完成后，為了得到L-茶氨酸產(chǎn)品需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離提取。與大多數(shù)發(fā)酵液一樣，L-茶氨酸的發(fā)酵液中殘留有菌體、雜蛋白以及未被利用的培養(yǎng)基等雜質(zhì)。因此合適的分離提取工藝就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)L-茶氨酸的理化性質(zhì)和發(fā)酵液的性質(zhì)制定了如圖4所示的分離提取工藝流程。該流程主要將膜過濾，陽離子交換樹脂脫色濃縮，活性炭脫色和濃縮結(jié)晶四部分單元操作結(jié)合起來分離提取L-茶氨酸。

圖4 從發(fā)酵液中分離提取L-茶氨酸的流程圖Fig.4 Flow chart of the L-theanine separation and purification

發(fā)酵液成分復(fù)雜，黏度較大，固液共存，首先要經(jīng)過初步處理去除其中的菌體以及可溶性蛋白和色素等大分子物質(zhì)。常用的去除菌體的方法包括離心法，絮凝法和膜過濾法[19]。微濾膜能有效分離0.1～10 μm的粒子，操作簡便，過濾效率高，不會(huì)造成產(chǎn)品污染，適合用于L-茶氨酸發(fā)酵液的菌體分離；超濾法操作簡便，安全性能高，常用于分離分子質(zhì)量>5 kDa物質(zhì)，因此更適合用于該單元操作。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)選擇微濾膜和超濾膜組合的方式對(duì)發(fā)酵液中L-茶氨酸進(jìn)行初步分離提取。

L-茶氨酸發(fā)酵液經(jīng)過膜過濾后有些色素還是無法去除，這將會(huì)影響下一步的分離純化，并導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量變差，所以需要進(jìn)行進(jìn)一步脫色處理才能進(jìn)行后面的操作。目前，常用的脫色方法主要有離子交換樹脂脫色和活性炭脫色。離子交換法具有效率高、操作簡單、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)上常用的濃縮和脫色方法之一[20]；活性炭脫色具有操作工藝簡單、設(shè)備投入少以及運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[21]，其中藥用活性炭具有脫色速度快、吸附能力強(qiáng)、內(nèi)部孔隙發(fā)達(dá)、孔隙粗大等特點(diǎn)，能夠有效吸附產(chǎn)品溶液中的色素，同時(shí)降低其中雜質(zhì)，不影響產(chǎn)品其他成分濃度[22]。由于L-茶氨酸結(jié)構(gòu)與L-谷氨酸較為接近，因此在乙醇中的溶解度較小，再結(jié)晶過程中使用冷乙醇可以增加晶體的析出率。重結(jié)晶操作是為了進(jìn)一步提高產(chǎn)品的純度，去除析晶過程中包裹的雜質(zhì)。

為了對(duì)比分離提取工藝中各步驟的分離效果，利用1.5中的公式對(duì)各步工藝中的細(xì)胞截留率Ycell、色素截留率Ypigment、蛋白截留率Yprotein和L-茶氨酸回收率進(jìn)行了計(jì)算，各步工藝分離效果如表4所示。微濾和超濾膜聯(lián)用能夠截留99.5%的細(xì)胞和95.5%的可溶性蛋白，但對(duì)于色素的截留效果只有71.7%。陽離子交換樹脂結(jié)合藥用炭處理能夠截留98.7%的色素，使得產(chǎn)品能夠以白色晶體形式析出。整個(gè)過程L-茶氨酸提取回收率可達(dá)到70.34%，經(jīng)高效液相色譜檢測成品純度可達(dá)到98.51%。

表4 分離提取工藝各步驟分離效果對(duì)比 單位：%

注：“-”表示無。

使用核磁共振對(duì)烘干后成品進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，圖5為產(chǎn)品的核磁共振氫譜圖，其中4.713 ppm處為試劑峰。由圖中峰面積和峰數(shù)目可知，該產(chǎn)品共含有1個(gè)甲基、1個(gè)次甲基和3個(gè)不同的亞甲基。由峰位移和峰裂分?jǐn)?shù)可知，上述每類基團(tuán)所處位置，將圖上的峰從右至左依次排列順序，得到位置如圖5所示。由偶合常數(shù)J可知該產(chǎn)品構(gòu)型為L型。之后與樣品核磁共振氫譜圖比對(duì)，確認(rèn)產(chǎn)品為L-茶氨酸。

圖5 L-茶氨酸產(chǎn)品的氫譜核磁共振圖Fig.5 NMR hydrogen spectrum of L-theanine product

3 結(jié)論

L-茶氨酸作為一種重要的食品添加劑和藥品添加劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。然而，現(xiàn)有的L-茶氨酸生產(chǎn)方法如提取法、化學(xué)合成法和酶催化法存在提取收率低、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高等不足。本研究通過Crispr/Cas9技術(shù)在大腸桿菌染色體上雙拷貝來自于Methylovorusmays的γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶基因gmas，得到的重組菌E.coligmas2經(jīng)過20 h乙胺流加發(fā)酵，L-茶氨酸產(chǎn)量可以達(dá)到30.45 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到20.17%，與現(xiàn)有的生產(chǎn)方法相比具有原料價(jià)格低廉、周期短、操作簡便、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)應(yīng)用價(jià)值較高。根據(jù)L-茶氨酸的物化性質(zhì)擬定出合適的分離提取路線，獲得了合格的L-茶氨酸產(chǎn)品，整個(gè)過程提取回收率可達(dá)到70.34%，成品純度可達(dá)到98.51%。本研究證實(shí)了使用重組大腸桿菌直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-茶氨酸是可行的，但是L-茶氨酸發(fā)酵水平還有待提高。后期可以針對(duì)前體物L(fēng)-谷氨酸合成涉及的糖酵解途徑以及三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)改造，進(jìn)一步增強(qiáng)α-酮戊二酸至L-谷氨酸的代謝流，進(jìn)而提高L-茶氨酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率。