郭兆斌，馬紀(jì)兵，張麗，陳騁，陳立業(yè)，劉勇，韓玲*，余群力

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅農(nóng)業(yè)工程咨詢?cè)O(shè)計(jì)所有限公司，甘肅 蘭州，730070)

牦牛是世界上生活在海拔最高處的哺乳動(dòng)物，主要分布在喜馬拉雅山脈和青藏高原等海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)[1]。中國牦牛占世界總數(shù)的90%，其中多數(shù)生長在西藏高原[2-3]。風(fēng)干牦牛肉是通過青藏高原地區(qū)冬季低溫低氣壓的天然氣候條件，將牦牛肉分割成條形后進(jìn)行自然風(fēng)干所制成的一種富有民族特色的儲(chǔ)藏性高的牦牛肉制品[4-5]。

肉制品在加工、貯藏、運(yùn)輸過程中極易發(fā)生氧化。氧化可分為脂質(zhì)氧化和蛋白氧化，兩者都具有相似的氧化過程。過度的蛋白氧化會(huì)影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，從而破壞氨基酸，對(duì)肉制品的加工特性和營養(yǎng)價(jià)值有不利影響；而脂肪氧化最終產(chǎn)生小分子的醛、酮等有機(jī)化合物會(huì)影響肉制品的風(fēng)味，產(chǎn)生不愉快氣味，抑制脂肪氧化在一定程度上可以抑制蛋白氧化[6]。牦牛肉及肉制品中含有一些氧化劑成分以及較高的不飽和脂肪酸，因而會(huì)使肌原纖維蛋白在生產(chǎn)加工過程中極易發(fā)生氧化[7]。李銀等[8]通過研究在—OH氧化模型下，H2O2濃度對(duì)于肌原纖維蛋白中的敏感氨基酸的氧化效應(yīng)，這為進(jìn)一步揭示肌原纖維蛋白氧化對(duì)氨基酸的影響提供了有力依據(jù)。有相關(guān)研究表明,牦牛肉在風(fēng)干加工中部分氨基酸含量會(huì)降低，高媛等[9]在研究中表明牦牛肉在風(fēng)干和后續(xù)加工過程中部分氨基酸含量會(huì)降低，而這些變化都與肌原纖維蛋白的氧化作用密切相關(guān)，但是對(duì)于肌原纖維蛋白氧化對(duì)氨基酸影響效果的研究目前鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)采用甘肅省甘南州公牦牛半膜肌為研究對(duì)象，分別在風(fēng)干加工過程中的0、2、4、6、8、10、20、30、40 d測定其半膜肌中羰基含量、巰基含量、二酪氨酸含量以及過氧化值(peroxide value,POV)和硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value，TBA)，并分析傳統(tǒng)風(fēng)干牦牛肉在加工過程中蛋白氧化和脂肪氧化對(duì)氨基酸的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣品：甘肅甘南公牦牛半膜肌約10 kg。

試劑：三羥甲醛氨基甲烷、KCl、K2HPO4、MgCl2、2,4-二硝基苯肼、乙二醇二乙醚二胺四乙酸，5,5′-二硫帶雙(2-硝基苯甲酸)、疊氮鈉、異硫氰酸胍、溴酚藍(lán)、尿素、KH2PO4、NaH2PO4、三氯乙酸、HCl、H2SO4、鉬酸銨、FeSO4(分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P紫外可見分光光度計(jì)，上海市美譜達(dá)儀器有限公司；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，西安省科昊生物工程有限責(zé)任公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)，江蘇金壇友聯(lián)儀器研究所；TGL-16MC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南省湘儀集團(tuán)；970CRT熒光分光光度計(jì)，天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)PARK等[10]的研究方法稍作修改，稱取1 g肉樣，加10倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH 6.8)均質(zhì)，4 ℃條件下離心10 min(1 000×g)，棄去上清，沉淀用8倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液溶解后，4 ℃離心10 min(1 000×g)棄上清，重復(fù)2次。沉淀用8倍體積100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃離心10 min(1 000×g)棄上清，重復(fù)2次。采用雙縮脲法定量蛋白。

1.3.2 羰基含量的測定

參考OLIVE等[11]的研究方法并做修改，在2.0 mL的離心管中，加入0.1 mL的蛋白溶液與0.5 mL 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液，25 ℃下反應(yīng)40 min，空白樣品中不加2,4-二硝基苯肼。然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸，振蕩后離心(11 000×g，5 min)棄上清，沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯溶液(體積比1∶1)洗滌3次，待溶劑揮發(fā)完后將蛋白質(zhì)懸浮于1 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中， 37 ℃條件下水浴保溫30 min。以空白溶液為對(duì)照，370 nm下測其吸光值，蛋白質(zhì)羰基衍生物的含量(nmol/mg蛋白)用摩爾吸光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 巰基含量的測定

參考LIU等[12]的試驗(yàn)方法測定巰基含量，取0.5 mL、2 mg/mL蛋白液(分散在25 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，pH 6.25)中，依次加入2 mL尿素-SDS溶液(含8.0 mol/L尿素，30 g/L SDS，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)和0.5 mL 10 mmol/L DTNB試劑(溶解在0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液中，pH 7.4)，在室溫下反應(yīng)15 min后于412 nm處讀數(shù)。0.5 mL 25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.25)代替蛋白液用于空白對(duì)照。摩爾消光系數(shù)為13 600 L/(mol·cm)。

1.3.4 二酪氨酸含量的測定

參考MALENCIK等[13]研究的方法測定二酪氨酸含量，將含有10 mg肌原纖維蛋白的懸浮液溶于3 mL高離子強(qiáng)度緩沖液(0.6 mol/L KCl，pH 6.0，20 mmol/L磷酸緩沖液)中，濾紙過濾除去殘留脂肪和不溶性物質(zhì)。雙縮脲法測定濾液蛋白含量。熒光光度法測定濾液中二酪氨酸含量，測定條件為：發(fā)射波長420 nm(狹縫5 nm)，激發(fā)波長325 nm(狹縫5 nm)。測定結(jié)果用熒光強(qiáng)度除以蛋白濃度，表示為相對(duì)熒光值。

1.3.5 過氧化值(POV)的測定

參考GB5009.227—2016中過氧化值的測定方法，稱取2～5 g風(fēng)干肉樣品置于250 mL碘量瓶中，加入50 mL乙酸-異辛烷溶液，勻漿混勻試樣。加入0.5 mL飽和KI溶液，蓋上蓋子搖動(dòng)1 min，然后在暗處放置3 min左右，取出加入30 mL蒸餾水后立即加入0.5 mL淀粉溶液，滴定至藍(lán)色消失，即為終點(diǎn)。同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。用過氧化物的毫克當(dāng)量數(shù)表示時(shí)，結(jié)果根據(jù)公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：X，過氧化值，g/100 g；V，試樣滴定消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL；V0,空白滴定消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL；C,硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,mol/L；m,試樣的質(zhì)量g；1 000,換算系數(shù)。

1.3.6 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定

使用JUNCHER等[14]的方法，準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g，與25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%(含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1% EDTA)三氯乙酸溶液和20 mL冷凍去離子水混合，均質(zhì)60 s，并在25 ℃的室溫下靜置20 min。然后將混合物離心10 min(6 000×g)，并用去離子水將上清液稀釋至50 mL。最后，取稀釋的上清液5 mL與0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸5 mL混合，并在95 ℃的水浴中保持20 min。通過流動(dòng)的水將反應(yīng)溶液冷卻至室溫后，在532 nm下測量吸光度并用去離子水作為空白對(duì)照。計(jì)算TBA如公式(2)：

TBA=A532×7.8

(2)

式中：A532，通過1.0 cm比色皿在532 nm處的吸光度。

1.3.7 氨基酸分析

參考國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中氨基酸的測定》(GB5009.124—2016)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均平行測定3次，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基含量變化

圖1為風(fēng)干牦牛肉加工過程中羰基含量變化，羰基是蛋白發(fā)生氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物。由圖1可知，羰基化合物含量隨風(fēng)干時(shí)間的延長呈逐漸上升的趨勢。原料肉中羰基含量為2.63 nmol/mg，風(fēng)干到40 d時(shí)達(dá)到8.16 nmol/mg，羰基含量增加了5.53 nmol/mg，風(fēng)干30 d時(shí)含量顯著低于風(fēng)干40 d時(shí)羰基含量(P<0.05)，0～30 d含量顯著低于40 d(P<0.05)。羰基是氨基酸發(fā)生氧化后的產(chǎn)物，它的產(chǎn)物的形成主要來自賴氨酸、脯氨酸、精氨酸等的直接氧化，并且其含量可作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化程度的重要指標(biāo)之一[15]。肌肉蛋白的氧化是一種具有非酶促的不可逆的蛋白化學(xué)修飾作用，這種修飾作用涉及到羰基基團(tuán)的形成，羰基基團(tuán)是在氧應(yīng)激作用下所形成的一種基團(tuán)[16]。羰基化合物的生成說明肌原纖維蛋白氧化程度的加劇，即羰基含量越高，肌原纖維蛋白氧化越劇烈[17]。

圖1 風(fēng)干牦牛肉加工過程中羰基含量變化Fig.1 Changes of carbonyl content in air-dried yakmeat processing注：圖中不同小寫表示差異顯著。下同。

2.2 巰基含量變化

肌原纖維蛋白巰基易被氧化而產(chǎn)生損失，巰基含量將會(huì)越低，氧化作用的程度越高。牦牛肉在自然冷凍風(fēng)干過程中的巰基含量變化如圖2所示。由圖2可知，隨著風(fēng)干時(shí)間的延長，巰基含量呈現(xiàn)出下降的趨勢，牦牛原料肉中巰基含量為71.03 nmol/mg，當(dāng)風(fēng)干到40 d時(shí)達(dá)到30.15 nmol/mg，含量降低了40.88 nmol/mg，風(fēng)干20 d時(shí)巰基含量顯著高于(P<0.05)40 d時(shí)巰基含量，0～20 d極顯著高于(P<0.01)40 d 時(shí)的巰基含量。肌原纖維蛋白中有大量的自由巰基，尤其在肌球蛋白中，每一個(gè)肌球蛋白大約含有40個(gè)巰基，由于牦牛肉風(fēng)干加工過程中肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了一定的改變，從而導(dǎo)致分子內(nèi)部的巰基暴露被氧化為二硫鍵，因此巰基含量降低[18]。故巰基含量的降低極有可能是因?yàn)榧≡w維蛋白中形成了多肽分子之間或內(nèi)部的二硫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)表面的巰基含量下降[19]。因此巰基含量的下降表明肌原纖維蛋白氧化加快，巰基含量越低，肌原纖維蛋白氧化程度越高[20]。

圖2 風(fēng)干牦牛肉加工過程中巰基含量變化Fig.2 Changes of sulfhydryl group content inair-dried yak meat processing

2.3 二酪氨酸含量的變化

二酪氨酸含量可用相對(duì)熒光值(A.U.)來表示。風(fēng)干牦牛肉加工過程中二酪氨酸含量變化情況如圖3所示。由圖3可知，隨冷凍風(fēng)干加工過程中時(shí)間的延長，二酪氨酸含量的A.U.值呈上升趨勢，在風(fēng)干加工0 d時(shí)，其A.U.值為28.9，至40 d時(shí)達(dá)到49.1，增加了20.2。在整個(gè)風(fēng)干加工過程0～40 d，二酪氨酸相對(duì)熒光值(A.U.)變化顯著(P<0.05)。酪氨酸是容易受活性氧自由基攻擊的敏感性氨基酸之一，而二酪氨酸是在其氧化之后的產(chǎn)物，故二酪氨酸的含量也可作為衡量蛋白質(zhì)發(fā)生氧化程度的重要指標(biāo)之一，即二酪氨酸含量越高，肌原纖維蛋白氧化程度越高[21]。

圖3 風(fēng)干牦牛肉加工過程中二酪氨酸含量變化Fig.3 Changes of dityrosine content in air-driedyak meat processing

2.4 POV值的變化

POV值反映脂質(zhì)發(fā)生一級(jí)氧化的程度，主要是脂肪降解產(chǎn)生的不飽和脂肪酸中的雙鍵與環(huán)境中的氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)形成的一種中間氧化產(chǎn)物[22]。風(fēng)干牦牛肉加工過程中POV值變化情況如圖4所示，由圖4可知，隨風(fēng)干加工時(shí)間的延長，POV值呈上升趨勢，在風(fēng)干0 d時(shí)，其值為1.16 mmol/kg，至40 d時(shí)達(dá)到1.85 mmol/kg，增加了0.69 mmol/kg。在風(fēng)干0～6 d，POV值變化顯著(P<0.05)且呈上升趨勢；在6～10 d變化不顯著，且6～10 d的POV值顯著低于20～40 d的(P<0.05)POV值。整個(gè)風(fēng)干過程POV值呈上升趨勢，過氧化值顯著增加，說明氫過氧化物的生成速率大于脂肪酸的生成速率，脂肪氧化程度進(jìn)一步加深。但是風(fēng)干的各階段差異顯著，原因可能是牦牛肉風(fēng)干成熟期間積累氫過氧化物，隨著風(fēng)干時(shí)間生成醛、酸、酮等物質(zhì)導(dǎo)致過氧化物的增多或者減少。

圖4 風(fēng)干牦牛肉加工過程中POV值的變化Fig.4 Changes of POV content in air-dried yakmeat processing

2.5 TBA值的變化

TBA反映脂肪發(fā)生二級(jí)氧化的程度。風(fēng)干牦牛肉加工過程中TBA值變化情況如圖5所示。由圖5可知，隨風(fēng)干時(shí)間的延長，TBA值呈上升趨勢，在風(fēng)干0 d時(shí)，其值為0.20 mg/kg，至40 d時(shí)達(dá)到0.69 mg/kg，增加了0.49 mmol/kg。風(fēng)干前期(0～8 d)變化不顯著，第8天值為0.29 mg/kg，僅比0 d時(shí)高出0.09 mg/kg；風(fēng)干后期(8～40 d)TBA值呈顯著上升趨勢(P<0.05)，40 d的值比8 d時(shí)高出0.40 mg/kg。風(fēng)干肉中脂類物質(zhì)在貯藏期會(huì)水解生成游離脂肪酸，在脂肪氧化酶的作用下氧化為氫過氧化物，然后進(jìn)一步分解為醛、酮等小分子終產(chǎn)物，此過程其主要產(chǎn)物為丙二醛，結(jié)果表明隨著風(fēng)干時(shí)間的延長，能促進(jìn)丙二醛等次級(jí)氧化產(chǎn)物的生成，進(jìn)而導(dǎo)致肌原纖維蛋白的氧化[23]。木卡代斯·木合旦爾等[24]發(fā)現(xiàn)羊火腿風(fēng)干成熟期間丙二醛含量先快速上升后緩慢上升、羰基含量也呈先急劇上升后緩慢上升的趨勢，與本文風(fēng)干牦牛肉得出的結(jié)論相似。風(fēng)干初期差異不顯著的原因可能是不穩(wěn)定的丙二醛被降解成揮發(fā)性化合物或與蛋白質(zhì)的游離氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。

圖5 風(fēng)干牦牛肉加工過程中TBA值的變化Fig.5 Changes of TBA content in air-driedyak meat processing

2.6 氨基酸分析

由表1可知，風(fēng)干牦牛肉共檢測出水解性氨基酸17種，大多數(shù)氨基酸的含量均隨肌原纖維蛋白氧化加劇而呈現(xiàn)輕微下降趨勢，氨基酸總量也隨之下降，風(fēng)干牦牛肉中的氨基酸總量為38.86 g/100 g，原料肉為42.12 g/100 g，即風(fēng)干牦牛肉氨基酸含量比原料肉低3.26 g/100 g，纈氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸及絲氨酸對(duì)氧化作用不敏感，氧化前后其含量變化不顯著。而半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸對(duì)氧化作用敏感，隨氧化時(shí)間延長，6種敏感氨基酸呈顯著下降趨勢，當(dāng)氧化時(shí)間達(dá)到40 d時(shí)，半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸的含量分別下降了51.2%、33.1%、18.9%、16.3%、47.9%和0.05%。異亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸是風(fēng)干牦牛肉中的主要鮮味氨基酸，它們的總量為18.99 g/100 g，這6種氨基酸是形成肉品香味物質(zhì)所必需的前體氨基酸，它們與形成肉制品的風(fēng)味有密切的關(guān)系，6種氨基酸中谷氨酸的含量是最高的，為6.58 g/100 g，約占鮮味氨基酸總量的34.65%，具有形成肉鮮味的作用和緩沖酸與咸等味道的特殊功能。風(fēng)干牦牛肉中的組氨酸含量為1.30 g/100 g，而原料肉中的含量是1.27 g/100 g，即表示風(fēng)干牦牛肉組氨酸含量比原料肉高出0.03 g/100 g，組氨酸是尿毒癥患者的必需氨基酸，對(duì)嬰幼兒來說也是必需氨基酸，同時(shí)，組氨酸會(huì)在脫羧之后形成組胺，具有很強(qiáng)的舒張血管的效果[25]。

牦牛肉在風(fēng)干加工過程中，隨著風(fēng)干時(shí)間的延長，羰基含量的上升，巰基含量的下降以及二酪氨酸含量的升高均表明肌原纖維蛋白發(fā)生了一定程度上的氧化，而蛋白發(fā)生氧化通常引起的變化是氨基酸的破壞，肽鏈的伸展斷裂以及蛋白交聯(lián)，從而導(dǎo)致肌原纖維蛋白功能性及理化性質(zhì)的改變[26]。雖然氨基酸側(cè)鏈容易遭受自由基與非自由基攻擊，并且氨基酸側(cè)鏈氧化會(huì)形成羰基化合物，但是不同的氨基酸對(duì)自由基有不同的靈敏性，比如蘇氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸及谷氨酸等氨基酸殘基通常會(huì)成為經(jīng)脂氧化產(chǎn)生的自由基攻擊的目標(biāo)[27]。這正好說明了這幾種氨基酸對(duì)氧化作用的敏感性更強(qiáng)。所以蛋白氧化會(huì)降低總氨基酸及必需氨基酸含量，同時(shí)，幾乎絕大多數(shù)氨基酸的含量都有不同程度的下降[28]。本試驗(yàn)研究表明，半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸對(duì)氧化作用非常敏感，纈氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸及絲氨酸對(duì)氧化作用不敏感，氧化前后其含量變化不顯著。

表1 風(fēng)干牦牛肉加工過程中氨基酸含量變化Table 1 Changes of amino acid content in air-dried yak meat processing

注：表中不同小寫字母表示差異顯著。

2.7 各氧化指標(biāo)與氨基酸相關(guān)性分析

由表2可知，酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量與羰基、二酪氨酸、POV值、TBA值均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；異亮氨酸含量與POV值及TBA值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與羰基及二酪氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；蛋氨酸與羰基及二酪氨酸含量均呈正相關(guān)，與巰基含量、POV值、TBA值呈負(fù)相關(guān)，不具有顯著性差異；半胱氨酸含量與POV值及TBA值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與羰基、二酪氨酸、巰基含量不具有顯著性差異；POV值、TBA值與羰基及二酪氨酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。綜上所述，風(fēng)干肉加工過程中肌原纖維蛋白氧化主要是由于脂肪氧化所引起的，亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對(duì)2種氧化作用最為敏感。

表2 各氧化指標(biāo)與氨基酸相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of oxidation indexes and amino acids

注：“*”表示相關(guān)性顯著(P<0.05);“**”表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

風(fēng)干牦牛肉在加工過程中，肌原纖維蛋白中羰基和二酪氨酸的含量顯著增加，巰基含量顯著降低；POV值和TBA值均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，表明風(fēng)干牦牛肉肌原纖維蛋白在風(fēng)干過程中蛋白氧化加劇。隨著肌原纖維蛋白氧化和脂肪氧化加劇，風(fēng)干牦牛肉中必需氨基酸含量均低于原料肉，風(fēng)干牦牛肉非必需氨基酸中組氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸及甘氨酸含量均高于原料肉。酪氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸對(duì)氧化作用非常敏感；纈氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸及絲氨酸對(duì)氧化作用不敏感，氧化前后其含量變化不顯著。