楊建偉,何樹(shù)梅,樊紅艷,劉紅旭

(西藏民族大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西咸陽(yáng) 712082)

結(jié)核病(tuberculosis)作為“死亡”和“消耗性疾病”的代名詞,數(shù)百年來(lái)困擾著醫(yī)生和科學(xué)家們,對(duì)于醫(yī)療水平高度發(fā)展的今天,結(jié)核病仍然危及著全世界人民的健康[1]。 對(duì)于結(jié)核病的預(yù)防和治療,我們依舊依賴于唯一的疫苗——卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG vaccine)并不能有效的預(yù)防結(jié)核病,幾種結(jié)核病治療藥物存在著治療周期長(zhǎng),容易耐藥等缺點(diǎn)[1]。 再加上潛伏性結(jié)核病的多發(fā),使結(jié)核病的預(yù)防和治療依舊是科學(xué)家們研究的難題。 在2019 年世界衛(wèi)生組織發(fā)表的結(jié)核病報(bào)告中顯示,2018 年全世界范圍內(nèi)仍有約1000 萬(wàn)人發(fā)病,并且這一數(shù)字在近幾年保持穩(wěn)定[2]。 出于結(jié)核病情的嚴(yán)峻性,研究人員對(duì)它的研究從未停止,而在結(jié)核病中發(fā)揮重要作用的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)一直備受關(guān)注。 腫瘤壞死因子正如它的名字一樣,這是一種能使腫瘤細(xì)胞出血性壞死的細(xì)胞因子,是一種強(qiáng)大的抗癌細(xì)胞因子,并且是調(diào)控炎癥的主要細(xì)胞因子[3]。 除了感染分枝桿菌的巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)以外,T 淋巴細(xì)胞、CD4 和CD8 細(xì)胞亞群、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)等也參與了腫瘤壞死因子的產(chǎn)生[4]。 TNF 是控制結(jié)核病的關(guān)鍵因子,可以通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的其他免疫細(xì)胞的聚集形成肉芽腫發(fā)揮保護(hù)作用。 TNF 拮抗劑治療疾病將會(huì)導(dǎo)致結(jié)核病的再激活風(fēng)險(xiǎn)增加,并且TNF 的中和會(huì)導(dǎo)致小鼠肉芽腫的組織紊亂,巨噬細(xì)胞發(fā)生溶解,表明TNF 對(duì)于維持肉芽腫的結(jié)構(gòu)是必不可少的[5]。 所以在結(jié)核進(jìn)程中,TNF 是一種非常重要的細(xì)胞因子,研究TNF 在結(jié)核病中的作用和機(jī)制能夠更好的了解結(jié)核病。 結(jié)核病的研究需要?jiǎng)游锬Ｐ?對(duì)于一些常用的動(dòng)物模型如鼠,某些非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物,受到成本和道德倫理的制約,并且老鼠復(fù)制人類病理能力也有局限性[6]。 近些年來(lái),斑馬魚-海分枝桿菌模型走進(jìn)人們的視線,越來(lái)越多的運(yùn)用于結(jié)核病的研究。 這是由于斑馬魚(Danio rerio,Zebrafish)幼魚通體透明易于觀察,特別是可以獨(dú)立研究先天免疫與細(xì)菌感染,而海分枝桿菌(Mycobacterium marinis)作為感染性的致病菌,和結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)在感染宿主方面有著類似致病機(jī)理和毒力因子,同樣可以存活于巨噬細(xì)胞內(nèi)[7]。 基因組研究表明這兩個(gè)物種之間有著密切的親緣關(guān)系,因?yàn)樗鼈冇写蠹s3000 個(gè)同源基因,平均氨基酸同源性為85%[8]。 傳統(tǒng)的結(jié)核菌研究只能在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,而海分枝桿菌的主要宿主是魚類和兩棲類,對(duì)人的感染是機(jī)會(huì)型的,所以海分枝桿菌的研究可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 由于海分枝桿菌感染斑馬魚以后,同樣會(huì)誘導(dǎo)受感染的巨噬細(xì)胞聚集,形成結(jié)核性肉芽腫[9],能夠很大程度上模擬人類結(jié)核病程。 并且Praveen 等[10]研究發(fā)現(xiàn)魚類與哺乳動(dòng)物的TNF-α 具有大致相同的基因同源性,并且生物學(xué)功能相似。所以應(yīng)用這個(gè)模型去探究TNF 在結(jié)核病中扮演的角色,可以很大程度上作為TNF 與人類結(jié)核病作用的參照。 TNF 的缺乏會(huì)導(dǎo)致人結(jié)核病發(fā)病幾率增加,并且結(jié)核分支桿菌感染小鼠肉芽腫組織紊亂,結(jié)構(gòu)破壞[5],鑒于目前TNF 信號(hào)在此過(guò)程中的作用尚不明確,因此需要對(duì)TNF 在結(jié)核病及其模型中的作用進(jìn)行綜述,本文是對(duì)近些年來(lái)TNF 在斑馬魚-海分枝桿菌模型上的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 在斑馬魚-海分枝桿菌模型中影響TNF 分泌的因素

1.1 細(xì)菌因素

1.1.1 海分枝桿菌SecA2 分泌位點(diǎn)對(duì)TNF 的影響

細(xì)菌存在蛋白輸送系統(tǒng),可以將蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,這一作用在細(xì)菌的生理和致病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。 除了正常的SecA 蛋白輸運(yùn)系統(tǒng)外,分枝桿菌還有一個(gè)蛋白分泌位點(diǎn)SecA2,這是一種與運(yùn)輸相關(guān)的ATP 酶[11]。 分枝桿菌SecA2蛋白分泌位點(diǎn)可以阻滯巨噬細(xì)胞吞噬小體的成熟,使細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中得以繼續(xù)生長(zhǎng)[12]。 在斑馬魚模型中,Watkins 等[13]使用缺乏SecA2 分泌位點(diǎn)的海分枝桿菌注入斑馬魚后很快被清除,無(wú)法在斑馬魚體內(nèi)寄生,證明海分枝桿菌上的SecA2 分泌位點(diǎn)是其生長(zhǎng)和生存所必須的。 接下來(lái)使用缺乏SecA2分泌位點(diǎn)的海分枝桿菌研究SecA2 分泌位點(diǎn)與TNF-α 分泌間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在小鼠還是斑馬魚體內(nèi),缺乏SecA2 分泌位點(diǎn)的菌株誘導(dǎo)生成的TNF-α 量都低于正常菌株所誘導(dǎo)生成的 TNF-α 的量,并且實(shí)驗(yàn)后期發(fā)現(xiàn)正常菌株在斑馬魚體內(nèi)誘導(dǎo)的 TNF-α 量是缺乏 SecA2 分泌位點(diǎn)菌株的 4 倍,雖然其中的機(jī)制尚不清楚,但是SecA2 分泌位點(diǎn)明顯在細(xì)菌感染后期增加了TNF-α 的合成[13]。

1.1.2 卡介苗接種對(duì)TNF 生成的影響

TNF 的發(fā)現(xiàn)和卡介苗的關(guān)系很是緊密,TNF 最初是由于將脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)注射到接種過(guò)卡介苗的小鼠體內(nèi)后,檢測(cè)小鼠血清發(fā)現(xiàn)的一種可以使腫瘤組織或細(xì)胞壞死的細(xì)胞因子[14]。一直以來(lái),卡介苗作為唯一的結(jié)核病疫苗被廣泛使用,但是接種卡介苗的人并不會(huì)不患結(jié)核病。 使用斑馬魚-海分枝桿菌模型能很好的呈現(xiàn)接種卡介苗以后機(jī)體的變化。 與人類一樣,斑馬魚接種卡介苗以后并不能完全避免海分枝桿菌的感染,但是斑馬魚抵抗力明顯增強(qiáng),探究斑馬魚接種卡介苗后細(xì)胞因子的變化,發(fā)現(xiàn)卡介苗疫苗能夠減少海分枝桿菌誘導(dǎo)的TNF 表達(dá),表明斑馬魚接種卡介苗會(huì)限制TNF 的過(guò)度表達(dá),有助于減少炎癥[15]。 與斑馬魚中的發(fā)現(xiàn)相似,接種卡介苗的小鼠體內(nèi)TNF-α 顯著降低,并且接種疫苗的小鼠體內(nèi)分支桿菌數(shù)量明顯減少,減輕了小鼠的肺部損害[16]。

1.2 宿主因素

1.2.1 白三烯 A4 水解酶( Leukotriene A4 Hydrolase,LTA4H)對(duì) TNF 的影響

白三烯水解酶是參與花生四烯酸代謝過(guò)程的一種酶,其作用是可以將LTA4 轉(zhuǎn)化為其另一種強(qiáng)效促炎物質(zhì)LTB4[17]。 當(dāng)斑馬魚感染海分枝桿菌時(shí),無(wú)論LTA4H 的表達(dá)水平過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)引起幼魚對(duì)分枝桿菌感染的高敏感性,使分枝桿菌數(shù)量增多,這一反應(yīng)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是與TNF 表達(dá)相聯(lián)系的[18]。 LTA4H 缺乏的時(shí)候,TNF 會(huì)缺乏,表現(xiàn)為細(xì)菌的數(shù)量的增加,最后使得巨噬細(xì)胞裂解,可以通過(guò)加入TNF 進(jìn)行補(bǔ)充控制細(xì)菌生長(zhǎng),而LTA4H 量過(guò)高的時(shí)候TNF 高表達(dá),雖然細(xì)菌的量有所減少,但是巨噬細(xì)胞還是會(huì)壞死,能夠使用敲除TNF 基因的方法進(jìn)行正常表達(dá)[18]。 除此之外,還可以通過(guò)抑制LTA4H 的生成降低TNF 的表達(dá)進(jìn)而控制炎癥。在大鼠身上的研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)使用白三烯A4 水解酶抑制劑,可以顯著抑制TNF 的生成[19]。

1.2.2 糖酵解抑制劑對(duì)TNF 生成的影響

當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染宿主時(shí),機(jī)體的先天免疫在對(duì)抗細(xì)菌的感染中發(fā)揮非常重要的作用,而巨噬細(xì)胞(macrophage)作為先天免疫中重要的一環(huán),一些對(duì)巨噬細(xì)胞起作用的因素可能會(huì)影響巨噬細(xì)胞與分枝桿菌之間的作用。 巨噬細(xì)胞受到結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)會(huì)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)變,從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?使巨噬細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌的存活受到限制[20]。 糖酵解對(duì)結(jié)核分枝桿菌的作用為結(jié)核輔助治療提供了新的研究方向,接下來(lái)研究人員使用2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-d-glucose,2-DG)糖酵解抑制劑進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制。 2-DG 作為一種葡萄糖類似物,可以抑制糖醇解,同時(shí)也是一種天然抗生素,已然發(fā)現(xiàn)它在治療癌癥、病毒感染、抗衰老、癲癇等相關(guān)疾病中有顯著療效[21]。 在2-DG 預(yù)處理過(guò)的海分枝桿菌感染的斑馬魚模型中,海分枝桿菌的增長(zhǎng)受到限制,使幼魚得到保護(hù)性生長(zhǎng),并且這種作用與TNF-α 相關(guān),因?yàn)槭褂?-DG 預(yù)處理后,斑馬魚體內(nèi)TNF-α 表達(dá)增加。 與此相反的是,當(dāng)斑馬魚被海分枝桿菌感染后再加入2-DG 并不能阻止海分枝桿菌的增長(zhǎng)[22]。 這與之前在小鼠模型中的研究一致,感染分枝桿菌的小鼠使用2-DG 處理后,發(fā)現(xiàn)肺部細(xì)菌數(shù)量增加,并且在離體的小鼠肺部細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TNF-α 分泌減少[23]。 總之,我們可以知道的是糖酵解對(duì)于結(jié)核感染來(lái)說(shuō)具有雙面性,2-DG 預(yù)處理可以增加TNF-α 表達(dá)量,進(jìn)而控制斑馬魚體內(nèi)海分枝桿菌的增長(zhǎng)。 而當(dāng)宿主感染分枝桿菌以后再阻斷糖酵解,則會(huì)損傷宿主免疫能力,導(dǎo)致分枝桿菌的增長(zhǎng)。

2 TNF 與斑馬魚結(jié)核性肉芽腫之間的關(guān)系

結(jié)核分枝桿菌感染宿主發(fā)病會(huì)形成典型的肉芽腫病理結(jié)構(gòu)。 把海分枝桿菌注入斑馬魚體內(nèi),發(fā)現(xiàn)斑馬魚對(duì)這一細(xì)菌感染十分敏感,會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生肉芽腫一樣的病理結(jié)構(gòu),而且還能觀察到發(fā)生干酪樣壞死,與人類結(jié)核性肉芽腫很是相似[24]。 斑馬魚因?yàn)槠溆佐~的通體透明性,能夠很好的觀察肉芽腫病理進(jìn)展和研究它的形成機(jī)制。 肉芽腫的形成需要巨噬細(xì)胞的參與,而巨噬細(xì)胞又與分枝桿菌存在緊密聯(lián)系。 Clay 等[25]發(fā)現(xiàn),在沒(méi)有巨噬細(xì)胞的條件下,海分枝桿菌不能遷移到宿主其他組織,表明巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了海分枝桿菌的體內(nèi)遷移。 而巨噬細(xì)胞對(duì)海分枝桿菌的這種運(yùn)輸能力并不需要TNF 的參與,因?yàn)樵谇贸齌NF 受體的斑馬魚幼魚中,巨噬細(xì)胞仍然能夠攜帶海分枝桿菌進(jìn)行跨膜運(yùn)輸[26]。對(duì)于巨噬細(xì)胞來(lái)說(shuō),TNF 的作用是將那些沒(méi)有被感染的巨噬細(xì)胞募集到感染初始部位和使已經(jīng)感染的或者沒(méi)有被感染的巨噬細(xì)胞聚集到一起[27]。 當(dāng)分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞時(shí),巨噬細(xì)胞上的TLR2 受體產(chǎn)生的腫瘤壞死因子,稱之為 TNF-α[28]。 由于TNF 與巨噬細(xì)胞之間的緊密關(guān)系,而肉芽腫的形成主要是巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的聚集,那么TNF與肉芽腫間必然有著聯(lián)系。 Clay 等[26]后期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在缺乏TNF 信號(hào)的斑馬魚中,肉芽腫形成數(shù)量增多,體積增大,并且細(xì)菌的生長(zhǎng)和體內(nèi)傳播加速,這是由于TNF 信號(hào)缺乏導(dǎo)致肉芽腫破損或者單個(gè)巨噬細(xì)胞死亡加速釋放胞內(nèi)海分枝桿菌。 類似的是,在TNF 缺乏的小鼠體內(nèi),分枝桿菌增長(zhǎng)速度加快,數(shù)量增多,而肉芽腫形成不受影響,只是形成延遲,結(jié)構(gòu)紊亂[5,29]。 斑馬魚實(shí)驗(yàn)研究表明,肉芽腫的形成并不需要TNF,而是通過(guò)抑制海分枝桿菌的生長(zhǎng)和防止巨噬細(xì)胞死亡來(lái)維持肉芽腫的完整性,所以TNF 對(duì)肉芽腫的維持至關(guān)重要[26]。

3 TNF 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的壞死

TNF 信號(hào)缺乏會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的壞死,而TNF表達(dá)過(guò)量也會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞有影響。 研究發(fā)現(xiàn),TNF過(guò)多會(huì)使得活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加,剛開(kāi)始時(shí)可以殺死斑馬魚體內(nèi)海分枝桿菌,對(duì)機(jī)體有益,但隨著ROS 的增加,巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生壞死,胞內(nèi)細(xì)菌釋放到胞外,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害影響[30]。 高 TNF 條件下的巨噬細(xì)胞壞死是通過(guò)RIP1-RIP3 激酶途徑介導(dǎo)的,該途徑介導(dǎo)的壞死需要ROS 的參與[30]。 細(xì)胞內(nèi)的ROS 主要是由線粒體生成的,線粒體的氧化損傷可以增加線粒體釋放如細(xì)胞色素c(cytc)這樣的蛋白通過(guò)線粒體外膜透化作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),從而激活細(xì)胞的凋亡機(jī)制[31]。 所以感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞RIP1-ROP3 激酶壞死途徑需要線粒體產(chǎn)生ROS 進(jìn)行介導(dǎo)。 高TNF除了在線粒體途徑誘導(dǎo)壞死,還有別的途徑。 通過(guò)抑制組織蛋白酶D,BID 和BAX 蛋白,TNF 介導(dǎo)的感染巨噬細(xì)胞的壞死也被抑制,這個(gè)途徑是由溶酶體介導(dǎo)的,溶酶體神經(jīng)酰胺通過(guò)激活組織蛋白酶D導(dǎo)致BID 激活進(jìn)而激活BAX 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的壞死[32]。 而BAX 介導(dǎo)壞死的機(jī)制是通過(guò)RyR 受體作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),促進(jìn)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入線粒體,最終導(dǎo)致線粒體鈣離子超載和壞死;而TNF 誘導(dǎo)的線粒體ROS 會(huì)使溶酶體活化,最后導(dǎo)致線粒體鈣離子超載,這就讓我們明白鈣離子超載需要 TNF 的參與[32]。 TNF 僅在感染的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體ROS 的產(chǎn)生,而線粒體ROS 會(huì)激活線粒體-溶酶體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回路,導(dǎo)致線粒體鈣離子超載和巨噬細(xì)胞壞死[32],所以ROS 將TNF 和各細(xì)胞器介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞壞死聯(lián)系在了一起。 關(guān)于TNF 介導(dǎo)的細(xì)胞壞死很早之前就有在小鼠模型中的相關(guān)報(bào)道,斑馬魚模型中TNF 介導(dǎo)的細(xì)胞壞死與小鼠模型中的發(fā)現(xiàn)是一致的,ROS 在壞死過(guò)程中扮演著重要角色,通過(guò)阻斷ROS 的生成,相關(guān)細(xì)胞的壞死也被抑制[33]。斑馬魚結(jié)核模型在更細(xì)致的角度研究了TNF 與巨噬細(xì)胞壞死之間的關(guān)系,還介紹了相關(guān)壞死途徑及與細(xì)胞器之間的關(guān)系。 我們還知道了鈣離子超載對(duì)巨噬細(xì)胞壞死的重要性,通過(guò)使用鈣離子拮抗劑去治療TNF 高表達(dá)的斑馬魚,發(fā)現(xiàn)TNF 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞壞死和鈣離子超載被抑制[32]。 鑒于鈣離子拮抗劑發(fā)揮的重要作用,在未來(lái)結(jié)核病的輔助治療中會(huì)有非常好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論與展望

以上我們重點(diǎn)介紹了TNF 在斑馬魚-海分枝桿菌模型上進(jìn)行的研究及取得的成果,加深了我們對(duì)TNF 在結(jié)核病程中扮演角色的理解,TNF 過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)引起巨噬細(xì)胞的壞死,假如要把TNF 作為結(jié)核的一個(gè)治療靶點(diǎn)還需要更加深入的研究。 要在之前的研究基礎(chǔ)上結(jié)合斑馬魚模型的優(yōu)勢(shì),可以把TNF 作為實(shí)驗(yàn)靶點(diǎn),無(wú)論是結(jié)核治療藥物還是疫苗開(kāi)發(fā)都可以利用斑馬魚模型結(jié)合對(duì)TNF 的作用進(jìn)行研究,比如目前應(yīng)用TNF 拮抗劑治療疾病引起潛伏性結(jié)核的再激活病例屢見(jiàn)不鮮,可以利用斑馬魚建立潛伏性結(jié)核病研究模型,探究TNF 拮抗劑激活潛伏性結(jié)核病的機(jī)制。 目前已經(jīng)有人將斑馬魚模型用于新藥的開(kāi)發(fā),盡管還處于探索階段,但是鑒于斑馬魚模型在結(jié)核研究和藥物測(cè)試中所取得的重要進(jìn)展,這個(gè)研究是非常有前景和價(jià)值的。 對(duì)于還沒(méi)被發(fā)現(xiàn)的可以影響TNF 表達(dá)量的因素,可以通過(guò)斑馬魚模型進(jìn)行驗(yàn)證。 斑馬魚作為結(jié)核病研究模型是可行的,其養(yǎng)殖周期短,幼魚通體透明可進(jìn)行可視化觀察,熒光探針技術(shù),高內(nèi)涵顯微鏡等都可用于斑馬魚的研究,并且遺傳操作技術(shù)成熟,再加上海分枝桿菌與結(jié)核分支桿菌的的類似致病機(jī)理和高基因組同源性,使用該模型進(jìn)行結(jié)核病的研究,將為人類結(jié)核病的探索提供新的見(jiàn)解和思路。 總之,通過(guò)斑馬魚-海分枝桿菌模型去研究TNF,對(duì)于一些還未被發(fā)現(xiàn)的TNF 觀點(diǎn),在之前的研究基礎(chǔ)上一定會(huì)取得新的發(fā)現(xiàn)。