邢君娜 王金麗 何新新 劉 婷 李 彬

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊 050000)

胸腺作為哺乳動(dòng)物重要的中樞免疫調(diào)節(jié)器官，是T細(xì)胞分化發(fā)育成熟的主要部位，并可分泌多種胸腺激素及激素類物質(zhì)[1]。胸腺為T細(xì)胞分化發(fā)育提供了最適宜的微環(huán)境,胸腺微環(huán)境主要由胸腺基質(zhì)細(xì)胞(thymic stromal cells,TSCs)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和細(xì)胞因子組成。其中胸腺基質(zhì)細(xì)胞類型較多，包括胸腺上皮細(xì)胞(Thymic epithelial cells，TECs)、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，其中TECs是胸腺微環(huán)境中最重要的成分，通過細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用及分泌一些可溶性分子影響不同發(fā)育階段的胸腺細(xì)胞發(fā)育成熟[2]。TECs根據(jù)其在胸腺中位置不同，分為分布在胸腺外側(cè)皮質(zhì)的皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(cortical thymic epithelial cells，cTECs)和分布在髓質(zhì)的髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(medullary thymic epithelial cells，mTECs)，胸腺細(xì)胞的發(fā)育和成熟是通過在胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)上皮細(xì)胞的遷移過程中相互作用完成的[3]。近期研究表明，相比大多數(shù)其他組織，TECs具有異常高的自噬體的數(shù)量。自噬的遺傳干預(yù),尤其是在TECs，會(huì)改變 T細(xì)胞特異性選擇，導(dǎo)致嚴(yán)重的大腸炎與多器官炎癥[4]。本文就胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)自噬在如何影響T細(xì)胞在胸腺內(nèi)成熟作一綜述。

1 自噬及其分子機(jī)制

自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的，通過對(duì)細(xì)胞質(zhì)成分、細(xì)胞器降解和再循環(huán)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程[5]。由于自噬是幾乎所有類型細(xì)胞維持其穩(wěn)態(tài)所需的基本過程，所以細(xì)胞內(nèi)均保持基礎(chǔ)水平的自噬[6]。除此之外，自噬對(duì)于細(xì)胞在饑餓、活化、生長和增殖等應(yīng)激條件下至關(guān)重要，為細(xì)胞提供必需的代謝中間體。這些基本的自噬功能與疾病和衰老有關(guān)，因?yàn)榫奂牡鞍踪|(zhì)，受損的細(xì)胞器或其他分子的積累是許多疾病的潛在問題。例如，自噬涉及克羅恩病、腫瘤、衰老和囊性纖維化等神經(jīng)退行性疾病，以及代謝相關(guān)疾病[7-9]。此外，自噬可以直接降解入侵病原體(異種自噬)，從而起到細(xì)胞自主免疫的作用[10]。自噬有三種不同類型，即分子伴侶介導(dǎo)的自噬、微自噬和巨自噬。其中巨自噬是最獨(dú)特的，因?yàn)樗诎|(zhì)裝載過程中形成了雙膜結(jié)構(gòu)，即自噬小體[11]。此外，也是研究最深入的自噬類型，并且由于這篇綜述涉及巨自噬，它將在下文中簡稱為“自噬”。

自噬的過程由成核、延伸、融合和降解四個(gè)不同的階段組成，降解的氨基酸等小分子物質(zhì)釋放回細(xì)胞質(zhì)以提供細(xì)胞的代謝功能[12]。自噬相關(guān)基因(autophagy relative gene，Atg)依次參與組裝并被錨定在雙層膜上來識(shí)別吞噬復(fù)合物，這最終導(dǎo)致吞噬復(fù)合物與細(xì)胞液隔離。到目前為止，在酵母中已有36個(gè)Atg蛋白質(zhì)被確定,形成自噬過程中不同的功能復(fù)合物[13]。自噬起始時(shí)，由UNC-51樣激酶1(ULK1)、200KDaFAK家族交叉蛋白(FIP200)和mATG101組成的ULK1復(fù)合物被募集到杯狀隔離膜的組裝位點(diǎn)上，ULK1復(fù)合物通過去磷酸化被激活后，開啟自噬通路[14]。磷脂酰肌醇3-羥基激酶(PI3K，也稱為hVsp34)復(fù)合物由hVsp34、p150、Beclin1和 Atg14L組成，有助于磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)產(chǎn)生，提供脂質(zhì)信號(hào)并招募其他自噬效應(yīng)器到吞噬泡促進(jìn)自噬的形成，如雙FYVE域蛋白(DFCP1)和WD重復(fù)蛋白與磷酸肌醇(WIPI)家族成員相互作用[15]。杯狀隔離膜成核后，兩種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)：Atg12-Atg5和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)-磷脂酰乙醇胺(PE)途徑，在自噬的延伸及閉合中發(fā)揮重要作用。在Atg12-Atg5途徑中，Atg7(E1泛素活化酶)活化后轉(zhuǎn)移至Atg10(E2泛素綴合酶)，Atg12與Atg5的內(nèi)部賴氨酸(底物蛋白)共價(jià)結(jié)合，形成Atg12-Atg5復(fù)合物，其進(jìn)一步與Atg16L相互作用形成Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合體[16]。在LC3-PE途徑中，LC3由Atg4(一種半胱氨酸蛋白酶)處理以暴露一種C-末端甘氨酸殘基，形成LC3I。然后，LC3I被激活并由Atg7轉(zhuǎn)移到Atg3(E2泛素結(jié)合酶)形成LC3I-Atg3復(fù)合物。最后，LC3I與PE共軛，形成LC3II-PE復(fù)合物，其在自噬體的形成及中必不可少[17]。在自噬小體形成后，自噬小體被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w并與其融合，形成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的一系列酸性水解酶將其內(nèi)容物降解，并釋放到細(xì)胞質(zhì)中被重新利用。該過程由溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP-2)、Rab7、紫外線輻射抗性相關(guān)基因(UVRAG)、ANARE和運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物(ESCRT)介導(dǎo)[18]。

2 T細(xì)胞在胸腺內(nèi)分化發(fā)育的階段

T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程。T細(xì)胞的選擇和成熟受胸腺細(xì)胞與胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)TECs之間的相互作用及其分泌的細(xì)胞因子調(diào)控[19,20]。主要是通過產(chǎn)生特異性T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)并通過識(shí)別自身抗原，形成自身耐受性T細(xì)胞，從胸腺輸出到外周的過程[21]。胸腺細(xì)胞作為T細(xì)胞的前身細(xì)胞在胸腺內(nèi)的分化發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的過程，大體上可以分為三個(gè)階段：①雙陰性細(xì)胞(Double negative，DN)階段：來自骨髓的淋巴干細(xì)胞遷移至被膜下區(qū)，位于此區(qū)的胸腺細(xì)胞為CD4-CD8-雙陰性細(xì)胞[22]。②雙陽性細(xì)胞(double positive，DP)階段：首先，根據(jù)CD25和CD44可進(jìn)一步區(qū)分CD4-CD8-雙陰性細(xì)胞的分化程度：CD44+CD25-(DN1)→CD 44+CD25+(DN2)→CD44-CD25+(DN3)→CD44-CD25-(DN4)[23]，其中Tcrb，Tcrg和Tcrd(分別編碼TCRβ，TCRγ和TCRδ鏈)基因位點(diǎn)的重排開始于DN2階段并在DN3階段完成[24]。而Tcrb重排對(duì)于大多數(shù)胸腺細(xì)胞向αβT細(xì)胞譜系分化至關(guān)重要。不能產(chǎn)生TCRβ鏈的胸腺細(xì)胞不能進(jìn)一步成熟并發(fā)生凋亡。通過功能性TCRβ鏈表達(dá)啟動(dòng)的過程被稱為β選擇。它涉及新生TCRβ鏈與恒定的pre-Tα(pTα)鏈配對(duì)形成pre-TCR過程，為DN4和DP階段的存活和進(jìn)展提供必需信號(hào)[25]。β選擇涉及大約5輪的增殖，在此期間，胸腺細(xì)胞下調(diào)CD25的表達(dá)成為DN4細(xì)胞，然后迅速上調(diào)CD4和CD8。分化為成熟的CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞[26]。③單陽性細(xì)胞(single positive，SP)階段：雙陽性細(xì)胞在受到cTECs呈遞的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)肽復(fù)合物時(shí)激活，并進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為SP階段。在這個(gè)階段中，與MHC-Ⅰ分子識(shí)別的形成CD8SP細(xì)胞，與MHC-Ⅱ分子識(shí)別的成為CD4SP細(xì)胞。從而進(jìn)一步分化發(fā)育為只表達(dá)CD4+或CD8+的單陽性細(xì)胞[27]。

3 自噬與T細(xì)胞分化發(fā)育過程

胸腺細(xì)胞的成熟過程實(shí)質(zhì)上是一種選擇過程，主要包括cTECs中的陽性選擇過程和mTECs中的陰性選擇過程[28]。陽性選擇是指在胸腺皮質(zhì)的cTECs中，T細(xì)胞表面表達(dá)的TCR能和自身MHC識(shí)別的T細(xì)胞被允許增殖、分化、發(fā)育成為成熟T細(xì)胞的過程，使其具有自身MHC限制性。也就是雙陽性胸腺細(xì)胞發(fā)育成熟為單陽性胸腺細(xì)胞的過程[29]。通常，MHC-Ⅰ類分子提呈細(xì)胞內(nèi)抗原給CD8+T細(xì)胞，MHC-Ⅱ類分子提呈細(xì)胞外抗原給CD4+細(xì)胞[30]。陰性選擇是指在胸腺髓質(zhì)mTECs中，對(duì)自身抗原應(yīng)答而不能識(shí)別異體抗原的單陽性胸腺細(xì)胞發(fā)生克隆缺失，即賦予其自身耐受性[31]。

研究表明，TECs是唯一的非造血細(xì)胞組成性表達(dá)MHC分子[32]，與專業(yè)的APC相比，其在捕獲和處理細(xì)胞外抗原的功能較弱[33]，表明了MHC提呈過程中可能的細(xì)胞內(nèi)替代途徑。內(nèi)源性加載MHC分子的候選途徑可能是TAP依賴途徑、分子伴侶介導(dǎo)的自噬及巨自噬[34]。其中，巨自噬被證明在其抗原提呈過程中可以與MHC相交叉，即細(xì)胞內(nèi)抗原被吞噬后，自噬小體與MHC區(qū)室而不是溶酶體相融合，從而提呈抗原表位[35]。且用綠色熒光蛋白(GFP)-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，TECs具有強(qiáng)烈的饑餓獨(dú)立的自噬活性。而在許多其他組織中，如肌肉等，僅在饑餓時(shí)自噬才被誘導(dǎo)并被檢測(cè)到[36]。表明TECs中自噬對(duì)胸腺內(nèi)T細(xì)胞選擇中抗原呈遞過程中不可或缺。

3.1自噬與T細(xì)胞的陽性選擇過程 胸腺皮質(zhì)內(nèi)T細(xì)胞陽性選擇過程是胸腺細(xì)胞表面形成的TCR與自身MHC識(shí)別的過程。能與自身MHC識(shí)別的胸腺細(xì)胞允許其克隆增殖，否則將發(fā)生凋亡[25]。通過自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3與胸腺冷凍切片中的H2-DM陽性區(qū)室共定位，獲得了功能性證據(jù)證明了TECs中自噬的關(guān)鍵作用是產(chǎn)生陽性選擇肽/MHC-II類配體[37]。因此，胸腺細(xì)胞TCR配體的形成對(duì)于其陽性選擇過程有著微弱的作用。此外，為了檢測(cè)自噬在T細(xì)胞選擇中的作用，將Atg5-/-或野生型小鼠胸腺移植到成年野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)Atg5缺陷小鼠與野生型小鼠相比胸腺細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了明顯變化。而對(duì)其TECs中MHC分子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MHC-Ⅰ類分子的表達(dá)正常而MHC-Ⅱ分子表達(dá)水平有輕微的降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證，通過對(duì)幾種MHC-Ⅱ限制性轉(zhuǎn)基因小鼠自噬干預(yù)，表明HA-TCR受體、SEP-TCR的血凝素和同源肽的呈遞通過自噬促進(jìn)，而通過AND和DEP TCR識(shí)別的同源肽的加載均未通過自噬促進(jìn)。除此之外，DO11.10 TCR特異性肽加載甚至似乎被自噬負(fù)調(diào)控。同時(shí)，對(duì)MHC-Ⅰ限制性轉(zhuǎn)基因TCR研究中發(fā)現(xiàn)，自噬的缺失對(duì)其配體的形成無明顯影響[38]。這些結(jié)果支持自噬和其他MHC加載途徑在陽性選擇期間通過促進(jìn)特定肽的呈遞來影響T細(xì)胞庫形成過程的假設(shè)。

為了證明自噬確實(shí)能夠模擬MHC-Ⅱ配體的組成，考慮到體外分離的TECs數(shù)量有限，不能進(jìn)行MHC配體的全面評(píng)估，應(yīng)用B-淋巴母細(xì)胞系在自噬存在或缺失時(shí)對(duì)MHC-Ⅱ結(jié)合肽進(jìn)行質(zhì)譜分析[39]。為了觀察cTECs上特定的MHC-Ⅱ類結(jié)合肽是否受到自噬的遺傳干擾的影響，研究中使用了一種單克隆抗體(Y-Ae)，它在被I-Ea來源的肽占據(jù)時(shí)識(shí)別I-Ab。通過對(duì)IE和IA分子的共分選，I-Ea52-68-I-Ab復(fù)合物在造血抗原呈遞細(xì)胞上(占所有I-Ab-肽復(fù)合物的10%)富集[40]。值得注意的是，這種復(fù)合物在cTEC上的代表性相對(duì)較低，并且假設(shè)這是由于cTEC以其特異性方式表達(dá)和/或處理的肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合I-Ab。當(dāng)分析來自F1(BALB/c×C57BL/6)Atg5-/-的cTECs時(shí)，發(fā)現(xiàn)與野生型對(duì)照相比I-Ea52-68-I-Ab復(fù)合物富集增加，而總MHC-Ⅱ水平卻相反[38]。這些發(fā)現(xiàn)提供了Atg5缺陷引起cTECs的MHC-Ⅱ配體的定量轉(zhuǎn)變的直接證據(jù)，進(jìn)一步表明cTECs中I-Ea52-68-I-Ab復(fù)合物的增加與自噬缺失引起的MHC-Ⅱ類結(jié)合肽降低，從而引起與I-Ab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合減弱。

3.2自噬與T細(xì)胞的陰性選擇過程 自噬除了在陽性選擇中的作用之外，在mTECs中組織限制性抗原(tissue-restricted antigens，TRAs)呈遞的陰性選擇過程中的功能是有爭(zhēng)議的[41]。盡管在正常條件下，研究顯示cTECs和mTECs中LC3表達(dá)在后者中程度較低，且通過LC3和MHC-Ⅱ區(qū)室共定位也證實(shí)了自噬的分布[42]。此外，當(dāng)抗原水平非常高時(shí)，自噬對(duì)于mTECs和APCs的多肽呈遞似乎是不必要的，APCs可以間接誘導(dǎo)陰性選擇。但在抗原水平較低時(shí)，mTECs中自噬依賴性肽的表達(dá)變得不可或缺[43]。

為了研究自噬在mTECs陰性選擇中的作用，有研究將Atg5缺陷型小鼠胸腺移植到無胸腺裸鼠體內(nèi)，導(dǎo)致了由免疫介導(dǎo)的組織炎癥浸潤及自身免疫性疾病的發(fā)生。且當(dāng)從該嵌合體分別轉(zhuǎn)移純化的CD4+和CD8+T細(xì)胞至裸鼠體內(nèi)時(shí)，CD4+T細(xì)胞比CD8+T細(xì)胞更易于誘發(fā)自身免疫性疾病，與Atg5缺陷的胸腺相一致，主要擾亂了CD4+T細(xì)胞的選擇[44]。但是這種自身免疫反應(yīng)的發(fā)生是否由于自噬缺失導(dǎo)致的陰性選擇過程中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的產(chǎn)生還是由胸腺輸出功能的損傷導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞減少，還有待研究進(jìn)一步證實(shí)。最近，Aichinger等[45]觀察了自噬存在或缺失時(shí)T細(xì)胞在陰性選擇中是否能夠識(shí)別mTECs表達(dá)和呈遞的自身抗原以及免疫逃逸現(xiàn)象的發(fā)生。首先，追蹤了識(shí)別模型抗原鴿細(xì)胞色素c/CYCS(PCC)的T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PCC以其天然形式表達(dá)為TECs中線粒體自身抗原時(shí)，在特異性CD4+T細(xì)胞陰性選擇過程中MHC-Ⅱ直接呈遞過程需要完整的自噬途徑。值得注意的是，當(dāng)PCC表達(dá)為膜蛋白時(shí)，該過程卻獨(dú)立于自噬。表明抗原的亞細(xì)胞分布影響抗原的直接過程是否依賴于自噬。此外，通過對(duì)相同的mTECs特異性抗原與“天然”和“突變”LC3融合，研究其是否靶向自噬體降解，結(jié)果表明當(dāng)表達(dá)相同水平抗原時(shí)，與突變組相比，自噬小體靶向模型抗原且特異性CD4+T細(xì)胞的陰性選擇過程效率更高[46]。

4 小結(jié)

正常機(jī)體的免疫系統(tǒng)能有效地區(qū)分“自身”與“異己”成分[47]。免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原的無反應(yīng)性是通過免疫耐受機(jī)制而形成。T細(xì)胞在胸腺發(fā)育期間，每個(gè)T淋巴細(xì)胞表面都會(huì)產(chǎn)生唯一且特異的TCR，由于其隨機(jī)性，這個(gè)過程不可避免地也會(huì)導(dǎo)致潛在的可能會(huì)識(shí)別“自我”的T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生[48]。自身耐受機(jī)制的破壞常導(dǎo)致多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生[49,50]。胸腺在形成中樞免疫耐受以及指導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)育中有著重要的作用[51]。綜上所述，TECs中自噬缺陷所引起的陽性選擇和陰性選擇的干擾可能協(xié)同促進(jìn)自身免疫。首先，cTECs上MHC配體組成的改變可能影響陽選，影響胸腺細(xì)胞TCR的形成，可能會(huì)促進(jìn)自身免疫。其次，mTECs損害的TRAs的呈遞可允許本應(yīng)被克隆刪除或者偏向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞譜系的自體反應(yīng)性胸腺細(xì)胞輸出到外周。因此，通過對(duì)胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)自噬進(jìn)行干預(yù)有可能通過影響T細(xì)胞在胸腺內(nèi)分化發(fā)育、成熟的過程，減少使自身反應(yīng)性T細(xì)胞輸出，從而預(yù)防自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，有可能成為未來治療及預(yù)防自身免疫疾病發(fā)生發(fā)展的新靶點(diǎn)和方向。