郭瀾 李莉 葛繼榮

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350003 2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)改變，以致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病[1]。早期調(diào)查顯示[2]，在我國50歲以上人群中，女性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率達(dá)20.7%，男性達(dá)14.4%。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)的“骨痿”“骨枯”等范疇，基本病機(jī)為腎虛精虧[3]。腎之精氣對骨骼的生長發(fā)育起到了至關(guān)重要的作用，用腎主骨生髓、腎藏精等理論指導(dǎo)中醫(yī)藥對骨質(zhì)疏松癥的防治，起到了較好的臨床療效。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)研究，“腎主骨生髓”理論得到了部分的科學(xué)證實(shí)，但對其內(nèi)涵的理解有待更進(jìn)一步的研究。外泌體是一類大小在30～120 nm，含有核酸、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的膜封閉的細(xì)胞外囊泡[4]。外泌體被其他細(xì)胞攝取后，可以實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞間的物質(zhì)交流和通訊，并且能通過影響受體細(xì)胞的信號通路，來改變周圍的微環(huán)境[5-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以調(diào)節(jié)骨代謝，與骨質(zhì)疏松癥有著密切的關(guān)系。本文旨在通過外泌體在骨代謝中的作用特點(diǎn)，探討“腎主骨生髓”理論與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，以此豐富“腎主骨生髓”理論的內(nèi)涵，也為其指導(dǎo)OP的防治提供新的研究思路。

1 “腎主骨生髓”理論與OP的關(guān)系

1.1 現(xiàn)代對“腎主骨生髓”理論的認(rèn)識

“腎主骨生髓”理論最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，其中《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“腎生骨髓”；《素問·痿論》曰:“腎主身之骨髓”。腎精封藏于腎中，可以化生骨髓以滋養(yǎng)骨骼，并且促進(jìn)骨骼生長發(fā)育。若腎精虧虛，骨髓生化無源，便會導(dǎo)致骨骼失養(yǎng)，出現(xiàn)骨軟無力，骨質(zhì)脆弱，臨床可見全身疼痛，易于骨折等OP的表現(xiàn)。因此，腎主骨生髓理論是中醫(yī)對OP最基礎(chǔ)及最具有概括性的認(rèn)識。中醫(yī)所講之腎，具有藏精，促進(jìn)人體生長發(fā)育、生殖和臟腑氣化等生理機(jī)能，并不僅僅是西醫(yī)解剖中指的腎臟?，F(xiàn)代研究中，主要是通過腎臟對鈣磷代謝的調(diào)節(jié)、腎臟分泌的1-α羥化酶的活性，以及影響下丘腦-垂體-靶腺軸的各種調(diào)節(jié)因子來理解“腎主骨生髓”理論[7]，這些調(diào)節(jié)因子被認(rèn)為是“腎主骨生髓”理論的物質(zhì)基礎(chǔ)。

其中1,25-(OH)2D3是一種類固醇激素,可調(diào)節(jié)鈣磷的代謝, 促進(jìn)骨基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)的形成[8]；促紅細(xì)胞生成素(EPO) 主要是促進(jìn)原始紅細(xì)胞的生成, 促進(jìn)骨髓內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅細(xì)胞的釋放,還可在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone- marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化[9]；骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7(BMP-7)[10-11]可增強(qiáng)BMSCs的成骨分化能力,并且可以與胰島素樣生長因子(insulin like growth factor,IGF)、甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)等一同促進(jìn)骨骼的重塑。通過對這些調(diào)節(jié)因子的研究，從現(xiàn)代分子生物學(xué)角度對“腎主骨生髓”理論有了進(jìn)一步的證實(shí)，使運(yùn)用補(bǔ)腎法防治骨相關(guān)疾病更具科學(xué)性。但是，這些調(diào)節(jié)因子大多是腎臟自身所分泌的，用于理解“腎主骨生髓”理論太過于局限，并不能很好地體現(xiàn)中醫(yī)的整體觀念。

1.2 “腎主骨生髓”理論與BMSCs

BMSCs屬于多功能細(xì)胞，在維持骨量中起著重要作用。BMSCs通過誘導(dǎo)可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等，可促進(jìn)骨骼形成，但其成骨分化的能力，會隨著年齡的增加而減弱[12]，這與腎精的特點(diǎn)是一致的。目前，在對運(yùn)用補(bǔ)腎藥物防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制研究中，促進(jìn)誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化，是眾多作用機(jī)制之一。王和鳴等[13]用中藥巴戟天的醇提物及水提物制備含藥血清，加入到用經(jīng)典成骨誘導(dǎo)方法所培養(yǎng)的BMSCs培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽藥巴戟天能夠促進(jìn) BMSCs的成骨分化。陳云剛等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎藥骨碎補(bǔ)的含藥血清可以通過激活wnt/β-catenin細(xì)胞通路，來促進(jìn)BMSCs的成骨分化。高璐等[15]將補(bǔ)腎藥淫羊藿、補(bǔ)骨脂、何首烏等的有效成分提取物制備含藥血清，培養(yǎng)大鼠BMSCs后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增值率與成骨分化能力都得到提高，其機(jī)制與補(bǔ)腎藥能夠上調(diào)RUNX2、OSX的基因表達(dá)有關(guān)。張玉卓等[16]分別將滋陰補(bǔ)腎代表方左歸丸、溫腎補(bǔ)陽代表方右歸丸的含藥血清干預(yù)大鼠BMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)左歸丸、右歸丸均能一定程度地促進(jìn)BMSCs的成骨分化。這些研究表明，補(bǔ)腎中藥、溫腎陽及養(yǎng)腎陰類方劑可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)骨代謝、增加骨量以治療骨質(zhì)疏松癥。在中醫(yī)“腎主骨生髓”的理論中，腎精的作用尤為關(guān)鍵。腎精一部分化為生殖之精，維持機(jī)體正常的生長發(fā)育與生殖機(jī)能，另一部分則化髓充養(yǎng)骨齒。BMSCs的功能與腎精的作用存在類似之處，可通過BMSCs的成骨分化來進(jìn)一步理解腎主骨生髓理論的內(nèi)涵。

2 外泌體與OP的關(guān)系

2.1 外泌體的研究現(xiàn)狀

外泌體是細(xì)胞分泌的具有穩(wěn)定雙層膜結(jié)構(gòu)的具膜小體，尺寸在 30～120 nm之間，可以選擇性地包裹大量生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等[17]。外泌體首次于1987年在綿羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[18]，之后在樹突狀細(xì)胞[19]、T細(xì)胞[20]、B細(xì)胞[21]等中都相繼有發(fā)現(xiàn)。在進(jìn)入細(xì)胞外微環(huán)境后，外泌體可通過膜融合的方式，將包裹的物質(zhì)傳遞到受體細(xì)胞中，進(jìn)行物質(zhì)的交流和傳遞，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)[22]。有研究表明[23-24]，骨重塑受到包裹在外泌體中關(guān)鍵因子的調(diào)節(jié)。越來越多的證據(jù)表明[24]，由外泌體介導(dǎo)的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間平衡的雙向信號傳遞，克服了病理性破壞性骨疾病導(dǎo)致的骨丟失。因此，用外泌體防治骨質(zhì)疏松癥具有很大的研究前景。

2.2 外泌體各成分對OP的影響

外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、microRNA等多種成分[25]。Xu等[26]首次報(bào)道了在BMSCs成骨分化過程中分泌的外泌體中含有miRNA，他們發(fā)現(xiàn)與其他來源的外泌體相比，其中miR-199B、miR-218、miR-148 A、miR-135B、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302B顯著上調(diào)。其中microRNA hsa-miR-135B可促進(jìn)BMSCs的成骨分化；miR-218以及Wnt信號通路，可以通過信號放大的方式促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的成骨分化[27]。既往研究已證實(shí)，外泌體中的miR-214廣泛參與骨形成及吸收過程[28-29]，miR-133 可參與調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化過程[30]。Lu等[31]報(bào)道，ADSCs來源的外泌體中包含了Wnt-3a蛋白，能夠增強(qiáng)人類初代成骨細(xì)胞的增殖能力和成骨分化能力，其中的 Wnt蛋白被報(bào)道與骨再生和骨環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有十分密切的關(guān)系[32]。并且，Li等[33]將AdSCs來源的外泌體植入小鼠顱骨缺損模型中，在顯微 CT下觀察到了成骨的效果。

2.3 外泌體對BMSCs的影響

眾多研究表明，外泌體對骨代謝的影響主要是通過調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化。Cui等[34]提取成骨細(xì)胞分泌的外泌體，并與BMSCs共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs表面RUNX2基因的表達(dá)以及堿性磷酸酶都顯著上調(diào)，這說明成骨細(xì)胞來源的外泌體能增強(qiáng)BMSCs成骨分化能力。人單核細(xì)胞分泌的外泌體對BMSCs也具有促成骨分化作用，該類外泌體與BMSCs共培養(yǎng)后，其細(xì)胞表面的成骨標(biāo)志基因RUNX2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)與對照組相比顯著增加[35]。人樹突狀細(xì)胞來源的外泌體對BMSCs的成骨分化亦有顯著促進(jìn)作用，經(jīng)其作用后的 BMSCs堿性磷酸酶的活性增強(qiáng)，成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RUNX2表達(dá)增加[36]。

2.4 干細(xì)胞來源的外泌體對OP的影響

非干細(xì)胞來源的外泌體，可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化，而研究表明干細(xì)胞來源的外泌體也能夠影響骨代謝。研究[37-38]發(fā)現(xiàn)，移植的外源性BMSCs分泌的外泌體可以通過調(diào)控宿主BMSCs的成骨分化功能，逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松，近期研究[39]發(fā)現(xiàn)，移植外源性細(xì)胞通過分泌外泌體影響宿主細(xì)胞的功能。宋子珺等[40]發(fā)現(xiàn)小鼠ADSCs分泌的外泌體，可以減少處于低氧缺血環(huán)境下的骨細(xì)胞凋亡，這表明ADSCs分泌的外泌體可以加快骨組織修復(fù)與再生。ADSCs來源的外泌體(ADSC-Exos)在成骨誘導(dǎo)的環(huán)境下能在體內(nèi)及體外促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[41]。朱夢茹等[42]報(bào)道，不同分化階段分泌的ADSC-Exos形態(tài)特征略有不同，ADSC- Exos能夠被原始ADSCs高效攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，成骨預(yù)處理的ADSC-Exos能夠于體外獨(dú)立誘導(dǎo)原始ADSCs成骨分化。ADSCs-Exos能夠有效地促進(jìn)人的初代成骨細(xì)胞(human primary osteoblastic cells，HOBs)增殖和分化為成骨細(xì)胞[31]，主要是通過增強(qiáng)Wnt-3a信號通路的表達(dá)，從而促進(jìn)HOBs向成骨細(xì)胞分化，達(dá)到骨修復(fù)和再生的目的。Qi等[43]將人誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的外泌體(hiPSC-MSC-Exos)與通過去除卵巢造模成功的OP大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs-OVX)一同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hiPSC-MSC-Exos 可以促進(jìn)rBMSCs-OVX的增殖和成骨分化能力，并且增加外泌體的濃度，rBMSCs-OVX的成骨分化能力也相應(yīng)得到提高。

3 從外泌體探討運(yùn)用“腎主骨生髓”理論防治OP

用中醫(yī)“腎主骨生髓”理論指導(dǎo)骨相關(guān)疾病，特別是對OP的防治，在臨床上已取得較好的療效。結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究，可以更好的理解、擴(kuò)展該理論的內(nèi)涵，使其更好地指導(dǎo)臨床。但對中醫(yī)腎的理解不能局限于西醫(yī)之腎臟，對“腎主骨生髓”理論的研究也不能局限于腎臟所分泌的物質(zhì)。BMSCs的成骨分化在骨代謝中起到了非常關(guān)鍵的作用，其功能與促進(jìn)機(jī)體生長、發(fā)育、生殖的“腎精”類似。腎精來源于先天之精，受后天之精的充養(yǎng)。腎藏精，精化氣，氣分陰陽，則為腎陰與腎陽。BMSCs與腎陽、腎陰在功能方面皆有聯(lián)系。腎陽能推動及激發(fā)臟腑各項(xiàng)機(jī)能，骨骼的生長發(fā)育也有賴于腎陽的推動，腎精促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育最主要的表現(xiàn)在于腎氣推動骨骼的發(fā)育，概括為“腎主骨”；BMSCs能分化為成骨細(xì)胞，直至骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨形成及維持骨的基本結(jié)構(gòu)，與腎陽的部分功能相通。腎陰可以涼潤臟腑形體官竅，腎陰足則有充足的津血以濡養(yǎng)骨骼，精生髓，髓居于腦及骨中，居于骨為骨髓，骨髓滋養(yǎng)骨，才能使骨骼保持堅(jiān)固有力，維持骨的正常生理功能，且腎精能化赤為血，給骨骼提供充足的營養(yǎng)；BMSCs來自于骨髓之中，與造血微環(huán)境相關(guān)，可促進(jìn)造血干細(xì)胞的造血功能[44]。因此，腎精及“腎主骨生髓”理論與BMSCs存在密切的關(guān)聯(lián)。

現(xiàn)代研究中，BMSCs的功能及分化受到眾多因子的調(diào)控，其中外泌體是一大影響因子。且外泌體對OP的影響主要是通過促進(jìn)BMSCs的成骨分化及調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡來實(shí)現(xiàn)的。特別是BMSCs來源的外泌體，對骨代謝的影響較為顯著。外泌體與既往研究中作為腎主骨生髓理論物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)因子類似，可以通過細(xì)胞間的信息傳遞來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理機(jī)能。在“腎主骨生髓”理論指導(dǎo)下運(yùn)用補(bǔ)腎藥物及方劑治療OP取得了一定的臨床療效，對其具體的作用機(jī)理也有相關(guān)研究，且主要是與BMSCs的成骨分化相關(guān)，但對于如何調(diào)控BMSCs的成骨分化方面研究不夠深入。外泌體對BMSCs的成骨分化的影響已有較為明確的研究證實(shí)，且具有影響作用的外泌體還包括非BMSCs所產(chǎn)生，這與“腎主骨生髓”理論中腎對機(jī)體的調(diào)控是全身性的相一致。因此，可以通過外泌體來探討“腎主骨生髓”理論與OP的關(guān)系，為運(yùn)用補(bǔ)腎法防治OP提供新的研究思路，也使“腎主骨生髓”理論可以更好的被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所理解和認(rèn)可。

4 總結(jié)與展望

通過對“腎主骨生髓”理論與OP的關(guān)聯(lián)性出發(fā)，根據(jù)外泌體在骨代謝中的生物學(xué)功能上與BMSCs關(guān)系密切并且與腎的生理功能存在一定的相關(guān)性，說明可以通過外泌體來探討“腎主骨生髓”理論防治OP的科學(xué)性。通過外泌體加深對“腎主骨生髓”理論的研究，豐富其內(nèi)涵，促進(jìn)中醫(yī)理論與現(xiàn)代研究相結(jié)合，為OP的防治提供更多的思路與指導(dǎo)。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)研究來理解中醫(yī)理論可以使得中醫(yī)經(jīng)典理論更具科學(xué)性，但終究不能完全體現(xiàn)中醫(yī)理論的內(nèi)涵。希望在今后的研究中，會有更好的辦法可以深入挖掘中醫(yī)理論的內(nèi)涵，使其得到更好的傳承和發(fā)展。