朱智慧，孟凡皓，夏嘉斌，徐曉鳳，胡 陽，張愛金，張 韜

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院口腔科，北京 100730 2北京信息科技大學光電測試技術(shù)及儀器教育部重點實驗室，北京 100192

癌癥是惡性腫瘤的泛稱，包括癌和肉瘤，是一組以細胞生長異常為特征的疾病。這種異常的生長方式具有侵襲性，有可能浸潤?quán)徑M織或轉(zhuǎn)移到遠處的器官。各種組織類型的癌癥造成了巨大的疾病負擔，2015年全球有9050萬人受到癌癥的影響[1]。每年有1400多萬人被確診癌癥，有880萬人死于該病[2]。頭頸部惡性腫瘤在全身癌癥發(fā)病率中占第6位[3]，嚴重威脅患者的生命安全，其中約1/3患者為口腔癌，以鱗狀細胞癌最常見[4]。口腔癌患者5年生存率常不足50%[5]，屬于生存率較低的惡性腫瘤，根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)[6]和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南[7]，當前針對口腔癌的治療方式是以手術(shù)為主的綜合治療[6]，原發(fā)灶切除的徹底性將直接影響患者生存率。目前臨床上對原發(fā)灶切除范圍的評估常有賴于術(shù)前X線、CT、MRI、B超及術(shù)者術(shù)中對腫物的觸診等，而病變組織活檢仍作為癌癥診斷的金標準。術(shù)中常依據(jù)切緣冰凍病理結(jié)果指導切除范圍，有相關文獻指出術(shù)中冰凍病理假陰性可達23%[7]，切緣陽性的患者常需術(shù)后放療、化療或二次手術(shù)，最終預后不佳，影響生存率。因此，找到一種便捷、精確判斷腫瘤邊界的新技術(shù)，指導腫瘤徹底切除，將有助于改善患者的預后和生存狀態(tài)。拉曼光譜作為一種能夠探測生物化學和生物分子的振動光譜技術(shù)，對癌細胞的光學診斷具有重要意義。目前已有報道應用不同拉曼光譜技術(shù)行口腔癌組織、血液、唾液等標本檢測及診斷，為口腔癌診治提供了新思路。本文總結(jié)了不同拉曼光譜技術(shù)在口腔癌診治中的應用進展。

拉曼光譜的原理、特點及分類

原理和特點1928 年，Raman等[8]發(fā)現(xiàn)了拉曼散射效應，該效應產(chǎn)生的光譜稱為“拉曼光譜”。拉曼光譜利用光的非彈性散射能夠提供細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的特定光譜特征，探測生物化學和生物分子結(jié)構(gòu)以及組織構(gòu)象，被稱為“指紋分子”。它具有高特異度、高分析效率及對各種復雜樣品(如各種體液、組織)無需染色或標記等特征，與其他成熟的醫(yī)學成像技術(shù)(如超聲、磁共振成像等)相比，拉曼光譜能以相對低的成本提供實時分子信息和高分辨率成像，對細胞的光學和表征診斷具有重要意義。而且，拉曼光譜具有非侵入性，可以直接對生物樣本(組織、血漿、唾液等)進行檢驗[9-10]，極大減輕了患者的痛苦及經(jīng)濟負擔，成為疾病診治、預后評價的新工具。

分類目前應用于醫(yī)學領域的拉曼光譜技術(shù)主要有以下4種：(1)顯微拉曼光譜與共焦顯微拉曼光譜技術(shù)：顯微拉曼光譜技術(shù)是將入射激光通過顯微鏡聚焦到樣品上，更為精確地獲得所照樣品微區(qū)的相關化學成分、晶體結(jié)構(gòu)、分子相互作用以及分子取向等各種拉曼光譜信息；共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)使顯微拉曼光譜具有更高的縱向分辨率，具有逐層層析及三維成像能力，可反映單個細胞的多維信息。(2)表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術(shù)：1974年，F(xiàn)leischmann等[11]第1次在吡啶吸附的粗糙銀電極上觀察到表面增強拉曼散射，該拉曼散射信號較原溶液中拉曼信號增強約106倍，具有更高的探測靈敏度及分辨率，可獲得高質(zhì)量的拉曼信號。(3)近紅外-傅里葉變換拉曼光譜(fourier transform Raman spectroscopy，F(xiàn)T-Raman)技術(shù)：干擾拉曼光譜靈敏度的一個重要因素是熒光現(xiàn)象，而FT-Raman很好地彌補了這一缺陷，它具有精確度高、測量頻率范圍廣、熱效應小等特點，在腫瘤組織檢測有諸多應用價值，在疾病診斷中可發(fā)揮一定作用。(4)光纖拉曼光譜技術(shù)(optical fiber Raman-based spectroscopy，OFRS)：拉曼光譜與光纖探針有效結(jié)合，無需特別制樣，便可直接對檢測樣本進行原位測量，提高收集效率。光纖探針的微型化使生物活體的拉曼光譜檢測成為可能，光纖表面鍍膜后能使拉曼散射作用增強，有利于檢測溶液中的微量組分。

常用拉曼光譜技術(shù)在口腔癌診斷中的應用

FT-Raman技術(shù)

檢測口腔鱗狀細胞癌、口腔黏膜下纖維化、口腔黏膜白斑和正?？谇火つぃ?014年，Krishna等[12]應用FT-Raman技術(shù)對113例口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、25例口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis，OSMF)、33例口腔黏膜白斑(oral mucosal leukoplakia，OLK)和28例健康志愿者口腔黏膜組織進行拉曼光譜測定，結(jié)果顯示，不同病理類型與正常情況相比，拉曼光譜都有明顯的不同，在不同病理類別之間的峰強度上可以觀察到細微差異，表明不同病理類型的組織中存在固有的生化差異，但病變組織間診斷準確率與正常相比下降3%。在對應拉曼光譜集合上應用一種基于概率的多分類診斷算法，其交叉驗證準確率提高6%，表明拉曼光譜和適當?shù)脑\斷算法有望在臨床上為口腔惡性和潛在惡性病變提供實時、無創(chuàng)的診斷。

檢測OSCC、口腔異常增生和正?？谇火つぃ?017年Li等[13]采用FT-Raman技術(shù)收集了OSCC、異常增生和口腔正常黏膜的拉曼光譜，通過結(jié)合支持向量機建立診斷模型，結(jié)果顯示，與正常黏膜相比，在口腔黏膜異常增生和OSCC中觀察到高含量的蛋白質(zhì)和DNA；不同異常程度的拉曼峰沒有顯著變化；輕度、中度、重度不典型增生與OSCC的比較準確率分別為100%、44.44%、71.15%，這說明支持向量機的建模能力較低，尤其是對中度異型增生者。但結(jié)合支持向量機，F(xiàn)T-Raman仍可以檢測口腔正常黏膜、OSCC和異常增生組織的生化變異。

檢測OSCC、OLK和正常口腔黏膜組織脫落細胞：2019年，Ghosh等[14]應用FT-Raman技術(shù)，對13例OLK、10例OSCC及同期11例正?？谇火つせ颊叩拿撀浼毎薪麱T-Raman檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)T-Raman可通過檢測口腔脫落細胞，區(qū)分OLK、OSCC及正?？谇火つ?；病變黏膜的脫落細胞在DNA、酰胺區(qū)域、蛋白質(zhì)和羥基區(qū)域的光譜發(fā)生了變化。該研究具有較高的準確性，且樣本獲取方便、無創(chuàng)，有望成為口腔癌臨床篩查工具。

激光共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)應用

檢測OSCC和正?？谇火つそM織：2014年，Behl等[15]應用激光共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，對10例正常和10例腫瘤未染色的切片行激光共聚焦拉曼檢測，結(jié)果觀察到，在正常切片中，上皮可分為基底層、中間層及表層；在腫瘤切片中分為腫瘤、基質(zhì)和炎癥區(qū)域。3層正常上皮細胞均可區(qū)分于腫瘤細胞：在上皮細胞中，基底層及表層可正常分類，而中間層則出現(xiàn)分類錯誤；在腫瘤中，可觀察到腫瘤細胞、腫瘤-基質(zhì)區(qū)和炎癥區(qū)。該研究表明拉曼圖譜可以在分子水平檢測正常和病變組織。

檢測口腔癌細胞、癌前病變及口腔正常上皮細胞系：Carvalho等[16-17]通過收集和分析口腔上皮癌SCC-4、癌前病變DOK細胞系和正?？谇簧掀ぴ毎暮巳省⒓毎撕图毎|(zhì)的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)口腔癌與正常細胞系之間的光譜存在顯著差異；此外，基于細胞質(zhì)區(qū)域的光譜可以區(qū)分癌前病變和癌細胞系；提示了核酸和蛋白質(zhì)對核仁及細胞質(zhì)區(qū)域脂質(zhì)變化的影響。2017年，鐘會清等[18]行人正?？谇簧掀ぜ毎蹬c舌鱗癌細胞CAL-27細胞系檢測，結(jié)果顯示靈敏度為96.8%，特異性為90.3%，診斷率為93.5%，可很好區(qū)分正?？谇火つど掀ぜ毎虲AL-27。因此，共聚焦顯微拉曼技術(shù)可用于區(qū)分口腔癌、癌前病變及正?？谇火つぜ毎?，為臨床快速篩查提供了一種新方法。

檢測舌鱗癌動物模型：2017年，鐘會清等[19]行裸鼠CAL-27人舌鱗癌細胞體外癌變模型與健康裸鼠拉曼光譜檢測，結(jié)果顯示其診斷靈敏度為96.8%～98.3%，特異性為90.3%～95.0%，診斷正確率為93.5%～96.7%，該方法可以很好地區(qū)分裸鼠CAL-27腫瘤組織及正常組織。

檢測口腔軟硬組織腫瘤與健康組織的水分含量，確定腫瘤邊界：Barroso等[20-21]采用共聚焦顯微拉曼技術(shù)對20例OSCC患者標本進行腫瘤內(nèi)部到周圍組織水的濃度變化檢測，結(jié)果顯示腫瘤邊界與水濃度變化有明顯的相關性，從腫瘤(76±8)%的水到健康周圍組織(54±24)%的水，含水量發(fā)生了轉(zhuǎn)變。因而拉曼光譜技術(shù)是一種很有前途的方法，可用于術(shù)中對腫瘤進行全面的檢查，指導手術(shù)切除范圍，完整切除腫瘤，其在術(shù)中邊緣評估中將有巨大應用潛力。2018年，Barroso等[22]和Smits等[23]繼續(xù)行因OSCC致頜骨部分切除標本的拉曼光譜檢測，結(jié)果進一步驗證了從頜骨組織腫瘤內(nèi)部到周圍組織水的濃度變化，為其在術(shù)中客觀、快速地評估手術(shù)邊緣，指導術(shù)中骨腫瘤切除提供一定的可能。

SERS技術(shù)應用

檢測口腔癌患者和正?；颊咄僖簶颖荆?016年，Connolly等[24]報道了基于銀納米粒子的SERS作為檢測OSCC的無標記、非侵入性研究，他們共收集了180例正常及120例確診為口腔癌患者的口腔唾液SERS光譜，結(jié)果顯示兩者有顯著差異，證明應用SERS光譜檢測唾液樣本具有非侵入性、快速診斷口腔癌的應用前景。

檢測口腔癌患者血清學樣本：2017年，Tan 等[25]采集實驗組135例OSCC、陽性對照組90例黏液表皮樣癌(mucous epidermoid carcinoma，MEC)、空白對照組145例正常組患者血清樣本，利用混合金納米粒子(gold nanoparticles，AuNPs)的SERS進行檢測，結(jié)果顯示，對于OSCC、MEC和正常血清樣本來說，NPs可作為適當?shù)奈镔|(zhì)去捕獲高質(zhì)量SERS。該研究結(jié)果表明，基于金納米顆粒的血清SERS用于OSCC的檢測和診斷有較大幫助。2018年，Xue等[26]對該組135例OCSS患者血清數(shù)據(jù)進行了腫瘤分期及組織學分級檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清樣品SERS光譜顯示出明顯的變化和差異，推測可能是由于血清中的生物分子(核酸、蛋白質(zhì)、脂類等)發(fā)生了變化。該研究表明，基于血清檢測的SERS對不同腫瘤分期的OSCC患者進行術(shù)前評估和預測以及組織學分類具有巨大的潛力，為臨床診斷提供一種新的手段，也為拉曼光譜在臨床惡性腫瘤診斷及預后提供了有力的實驗驗證。

檢測成纖維細胞系及OSCC細胞系：2018年，Dai 等[27]報道了金納米顆粒用作SERS散射底物，檢測成纖維細胞系SAS、人口腔鱗狀細胞癌細胞系SCC4，結(jié)果顯示，口腔癌細胞和正常成纖維細胞系之間拉曼光譜存在顯著差異，且基于細胞系的腺嘌呤拉曼信號，有望成為癌癥拉曼光譜檢測的新方法。

OFRS技術(shù)應用

檢測癌前/惡性組織與正常黏膜和良性組織：2015年，Guze等[28]應用OFRS技術(shù)，對2例口腔炎癥、1例真菌感染、1例白斑、1例輕度異常增生、1例中度異常增生、1例重度異常增生、11例SCC患者及18例正常黏膜患者行在體OFRS檢測，首次成功地獲得了體內(nèi)拉曼光譜，將癌前/惡性組織與正常黏膜和良性組織進行了比較。盡管該研究檢測樣本量小，但說明拉曼光譜在口腔不同病變的鑒別中可能發(fā)揮重要作用。2016年，Carvalho等[29]應用OFRS技術(shù)區(qū)分正常、炎癥、潛在惡性、良性和惡性口腔病變，結(jié)果顯示，OFRS對于區(qū)分口腔病變和正常黏膜是有效的，其中觀察到與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和碳水化合物的振動模式相關的生化信息。OFRS技術(shù)能夠區(qū)分不同類型口腔病變的生化信息，有望用于微創(chuàng)、早期的診斷。

檢測腫瘤組織及正常黏膜光譜，預測腫瘤復發(fā)情況：2017年，Malik等[30]通過OFRS進行了口腔腫瘤潛在復發(fā)的研究，獲取了99例口腔癌患者的腫瘤和對側(cè)正常黏膜在體拉曼光譜，并對其進行隨訪觀察，結(jié)果顯示，正常黏膜光譜被錯誤分類到腫瘤組的患者，其局部復發(fā)的可能性較正確分類者高1.5倍；拉曼光譜預測復發(fā)的敏感性為80%，特異性為29.7%。該項研究作為一種前瞻性驗證，可以預測受試者的復發(fā)傾向，若經(jīng)過大量驗證，應用于臨床隨訪，則可提醒患者密切隨訪。

檢測OSCC與健康舌組織分子組成：2018年，Cals等[31]應用OFRS對21例患者的44份舌標本，共獲得1087份組織病理學注釋譜(142份OSCC，202份表面鱗狀上皮，61塊肌肉，65個脂肪組織，581個結(jié)締組織，26個腺體，10條神經(jīng))。每個組織結(jié)構(gòu)的特征平均譜與參考譜相擬合，確定最佳的譜庫。參考光譜代表蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、碳水化合物、氨基酸和其他雜類分子，然后將每個組織病理學注釋的單個光譜與所選文庫進行擬合，以確定每個組織結(jié)構(gòu)的分子組成。研究提出的模擬和解釋OSCC與健康口腔組織結(jié)構(gòu)之間的光譜差異的方法，為區(qū)分這些組織(碳水化合物、蛋白質(zhì)和氨基酸的相對濃度)的生物化學參數(shù)提供了新的見解。研究顯示，碳水化合物、蛋白質(zhì)和氨基酸的含量是OSCC與健康組織的最大鑒別指標。與既往將含水量作為區(qū)分腫瘤與周圍健康組織不同，該研究在空氣干燥的薄組織切片上進行，通過分析其他化學類別的含量，可以獲得額外的鑒別信息，為腫瘤組織分子組成研究提供了新思路。

總結(jié)與展望

拉曼光譜作為一種新型的無創(chuàng)檢測方法[32]，可以反映癌癥發(fā)展過程中涉及的多種分子變化[31]，發(fā)現(xiàn)正常組織到癌變的惡性轉(zhuǎn)化過程中的生化組成和結(jié)構(gòu)的改變，不但可以避免組織活檢給患者帶來的痛苦與負擔，而且隨著拉曼光譜技術(shù)的不斷完善，以及科研人員的不斷創(chuàng)新，通過檢測腫瘤與不同程度病變組織，已實現(xiàn)從分子層面區(qū)分腫瘤與正常組織；通過檢測患者血清學標本，實現(xiàn)從分子水平區(qū)分不同腫瘤分級，有望成為臨床癌癥早期診斷、術(shù)中實時檢測的新手段。但該項技術(shù)仍處于初步研究階段[32]，其用于癌癥篩查、診斷及邊界識別的標準尚未統(tǒng)一，還需進行大規(guī)模的臨床試驗，以獲得足夠規(guī)模的光譜庫用于研究和分析，繼而開發(fā)臨床可用的便攜診斷儀器。

綜上，F(xiàn)T-Raman、顯微拉曼、SERS、OFRS等拉曼光譜技術(shù)已應用于口腔癌組織、不同程度病變組織、血液、唾液及細胞系等檢測，以區(qū)分不同程度的口腔病變、預測腫瘤復發(fā)及識別軟硬組織腫瘤邊界。不同拉曼光譜技術(shù)各具特點，F(xiàn)T-Raman用于檢測口腔脫落細胞，有望成為快速篩查工具；顯微拉曼可通過檢測細胞核、細胞質(zhì)及水份含量區(qū)分腫瘤及正常組織；SERS用于血清學及唾液樣本檢測時，可以預判腫瘤分級及評估預后，具有較為重要的臨床意義；而OFRS因其探針小，可實現(xiàn)在體檢測，有望實現(xiàn)在體口腔腫瘤邊界實時感知，若將該技術(shù)集成于機器人機械臂，有望實現(xiàn)OFRS引導下機器人口腔腫瘤切除，還可拓展應用于其他醫(yī)學領域，具有較好的應用前景。