毛 妮，陳進(jìn)偉，王 佳，謝 希，李 芬，劉一鳴

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 中南大學(xué)臨床免疫中心，長(zhǎng)沙 410021

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)，并可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，嚴(yán)重者可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直。AS的發(fā)病因素復(fù)雜，人類基因組學(xué)研究顯示，AS是一種與遺傳基因高度相關(guān)的疾病，并揭示了其特異的免疫通路，包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17/IL-23通路、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)激活、氨基酸修飾后的主要組織相容性復(fù)合體(magjor histocompatibility，MHC)提呈，以及其他基因控制的CD8+和CD4+T細(xì)胞亞群等。H?hler等[1]對(duì)單卵雙胞胎AS患者免疫學(xué)參數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然90%的AS患者攜帶人類白細(xì)胞抗原-B27(human leukocyte antigen-B27，HLA-B27)基因，但是HLA-B27Ⅰ類抗原對(duì)于AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的估計(jì)僅約20%～50%，提示在AS患者中可能存在基于非基因序列改變的基因表達(dá)調(diào)控功能紊亂。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)與自身免疫性疾病之間關(guān)系的研究重點(diǎn)，DNA甲基化使基因靜默，而去甲基化使基因活化，成年后基因組甲基化狀態(tài)的改變通常具有致病性[2-3]。由于DNA甲基化所需要的一碳單位通過(guò)葉酸代謝通路提供，作為葉酸代謝通路的一個(gè)重要代謝酶-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)的活性與甲基基因供應(yīng)存在緊密聯(lián)系。目前已有研究表明，MTHFR基因多態(tài)與紅細(xì)胞葉酸水平和基因組甲基化程度有關(guān)，而這種基因突變相關(guān)的表觀遺傳修飾改變介導(dǎo)了疾病的發(fā)生[4-5]。綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前針對(duì)AS發(fā)病機(jī)制的表觀遺傳學(xué)研究尚少，主要集中在HLA-B27基因和CD4+T細(xì)胞。本研究評(píng)估了AS基因組DNA甲基化模式及其與MTHFR基因多態(tài)性之間的關(guān)系，探討了MTHFR基因多態(tài)性和DNA去甲基化在AS發(fā)病中可能的作用機(jī)制，以期指導(dǎo)AS的診療和新藥研制。

對(duì)象和方法

對(duì)象2011年9月1日至2013年12月31日在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的HLA-B27(+)AS患者200例(AS組)，均符合1984年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)，其中，男157例，女43例，平均年齡(23.5±9.0)歲(14～50歲)，平均病程(9.6±5.0)個(gè)月(4～36個(gè)月)。2013年1月1日至2013年12月31日在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院體檢中心隨機(jī)選取健康人120名(對(duì)照組)，其中，男89人，女31人，平均年齡(26.0±6.6)歲(20～55歲)；兩組受試者在性別(χ2=0.079，P=0.750)和年齡(t=1.714，P=0.100)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

主要試劑與儀器DPC Immulite全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購(gòu)自德國(guó)Siemens公司，PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購(gòu)自加拿大BBI公司，紫外光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司；人血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)試劑盒購(gòu)自美國(guó)TPI公司，紅細(xì)胞葉酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，Epitect Bisulfite Kit購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司。

樣本采集與處理所有受試者均于晨起空腹采肘正中靜脈血6 ml，EDTA抗凝，立即置于4℃冰箱中，在1 h內(nèi)4℃ 3500 r/min(r=10 cm)離心10 min，血漿置-20℃冰箱冷凍待測(cè)(實(shí)驗(yàn)時(shí)于37℃溫浴并混勻后使用)；余下抗凝血采用北京天根生物技術(shù)公司提供的DNA提取試劑盒，提取DNA-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA甲基化水平檢測(cè)采用胞嘧啶延伸法，取2 μg DNA，加入1 μl核酸內(nèi)切酶HpaⅡ(TaKaRa Biotechnology公司)，5 μl 10XNEB buffer，雙蒸水補(bǔ)至總體積50 μl，37℃消化過(guò)夜；56℃延伸1 h，然后置于冰上；取雙份10 μl反應(yīng)液點(diǎn)于whatman DE-81離子交換濾紙上，用磷酸鈉緩沖液(PH 7.0)室溫下洗3次。干燥濾紙，液閃計(jì)數(shù)。相對(duì)[3H]-dCTP參入率/μg DNA為酶處理樣本放射標(biāo)記參入率或背景放射標(biāo)記參入率。

血漿Hcy濃度檢測(cè)按照血漿Hcy濃度檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作(美國(guó)TPI公司)。

紅細(xì)胞葉酸濃度檢測(cè)按照紅細(xì)胞葉酸濃度檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作(美國(guó)Beckman公司)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較首先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊使用t檢驗(yàn)，方差不齊使用t’檢驗(yàn)；多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析(analysis of variance，ANOVA)；葉酸濃度、血漿Hcy濃度和基因組DNA甲基化水平的比較采用M和95%CI表示，組內(nèi)各基因型比較采用方差分析，兩組各基因型比較采用t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

MTHFR C677T多態(tài)性與AS的關(guān)系A(chǔ)S組患者M(jìn)THFR基因位點(diǎn)C677TT基因型的比例明顯高于正常對(duì)照組(17.0% 比 5.0%；χ2=9.874，P=0.002)，兩組在677CC(χ2=3.017，P=0.082)和677CT基因型(χ2=0.714，P=0.714)比例方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

MTHFR C677T各基因型血漿Hcy濃度的比較AS組的血漿Hcy濃度為(18.71±2.42)μmol/L，明顯高于正常對(duì)照組的(10.97±2.93)μmol/L(t=24.402，P<0.001)；AS組MTHFR基因位點(diǎn)C677CC(t=17.402，P<0.001)、C677CT(t=16.166，P<0.001)、C677TT基因型(t=10.686，P<0.001)的血漿Hcy濃度均明顯高于相應(yīng)正常對(duì)照組(表2)。以血漿樣本實(shí)測(cè)OD值所對(duì)應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)(Y軸)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，r=0.9975，兩者相關(guān)性良好。AS組中MTHFR基因位點(diǎn)C677CC、C677CT和C677TT基因型組的血漿Hcy濃度分別為(18.31±1.94)、(17.80±2.18)和(21.70±1.80)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=225.039，P=0.000)，其中C677CC(q=12.088，P=0.01)和C677CT基因型組(q=6.496，P=0.01)的血漿Hcy濃度均明顯低于C677TT基因型組。

MTHFR C677T多態(tài)性、血漿Hcy濃度、紅細(xì)胞葉酸濃度與基因組DNA甲基化水平的關(guān)系A(chǔ)S組MTHFR 677位點(diǎn)各基因型DNA甲基化水平與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 29.806，P<0.001)；AS組MTHFR 677位點(diǎn)各基因型間DNA甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.088，P<0.001)；AS組C677TT基因型基因組DNA甲基化水平明顯低于正常對(duì)照組(t=5.655，P<0.001)和AS組的C677CC(t=11.514，P<0.001)及C677CT基因型(t=10.287，P<0.001)。AS組MTHFR 677位點(diǎn)各基因型紅細(xì)胞葉酸濃度與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.699，P=0.404)。AS組C677CC(t=17.402，P<0.001)、C677CT(t=16.166，P<0.001)和C677TT基因型(t=10.686，P<0.001)的Hcy濃度均明顯高于正常對(duì)照組(表3)。

討 論

隨著表觀遺傳學(xué)研究的飛速發(fā)展，目前已經(jīng)證實(shí)各種不同類型的表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制都與自身免疫疾病發(fā)生有關(guān)，由環(huán)境等因素導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)表觀遺傳穩(wěn)態(tài)的紊亂，可引起基因異常表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞的分化及反應(yīng)性發(fā)生改變，與免疫性疾病發(fā)病密切相關(guān)[6]。綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前針對(duì)AS發(fā)病機(jī)制的表觀遺傳學(xué)研究尚少，主要集中在HLA-B27基因和CD4+T細(xì)胞。Appel等[7]對(duì)AS患者滑膜及外周血CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞處于去甲基化狀態(tài)，這種甲基化修飾的改變?cè)黾恿宿D(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，而Foxp3的過(guò)度表達(dá)被認(rèn)為與自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。另有研究表明，DNA甲基化與組蛋白去乙?；擅黠@上調(diào)HLA-B27基因表達(dá)水平[8]。本課題組以往研究顯示，AS患者M(jìn)THFR基因T/T型突變是高Hcy血癥的重要影響機(jī)制，而高Hcy血癥是AS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示MTHFR基因多態(tài)性與AS發(fā)病有關(guān)[9]?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，我們認(rèn)為MTHFR基因雖然不是AS的易感基因，但卻在AS發(fā)病中起著重要的作用，其具體作用機(jī)制在本次研究中得以進(jìn)一步揭示。本研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因677位點(diǎn)多態(tài)性、DNA甲基化水平與AS的發(fā)病相關(guān)，MTHFR基因677位點(diǎn)T/T型突變可導(dǎo)致AS基因組DNA低甲基化，MTHFR基因677位點(diǎn)T/T型突變導(dǎo)致血漿Hcy濃度升高。由于MTHFR可以催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，5-甲基四氫葉酸作為一碳單位的供體參與Hcy甲基化生成甲硫氨酸，甲硫氨酸活化S-腺苷甲硫氨酸并作為甲基的供體參與許多代謝反應(yīng)。如果MTHFR發(fā)生突變或者功能異常，就會(huì)導(dǎo)致合成的 5-甲基四氫葉酸相對(duì)于生成新的甲硫氨酸嚴(yán)重不足，使Hcy的轉(zhuǎn)硫基和甲基化過(guò)程出現(xiàn)障礙，進(jìn)而Hcy堆積、葉酸代謝障礙，最終導(dǎo)致基因組DNA 和一些特殊基因的低甲基化，這種改變和基因突變一樣可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。綜上，在AS患者中存在非基因序列改變導(dǎo)致的DNA表達(dá)調(diào)控功能的紊亂。MTHFR 677位點(diǎn)T/T型突變?cè)黾覣S發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制與其引起DNA甲基化狀態(tài)紊亂有關(guān)。MTHFR基因多態(tài)性通過(guò)降低MTHFR活性，減少甲基供體導(dǎo)致高Hcy血癥和DNA低甲基化而與AS發(fā)病相關(guān)。高Hcy血癥致AS的確切機(jī)制目前仍不十分清楚，但已有研究結(jié)果表明，高Hcy血癥可增強(qiáng)對(duì)炎癥因子的激活作用、觸發(fā)自身免疫機(jī)制[10-11]；Hcy還可以通過(guò)修飾T細(xì)胞的HLAⅠ類抗原，如HLA-B27分子及其他表面分子等，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能發(fā)生異常，使CD4+T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[12]。

表1 MTHFR C677T基因多態(tài)性基因型頻率在AS組和對(duì)照組間的比較[n(%)]Table 1 Genotype frequencies of MTHFR C677T polymorphism in AS group and normal control group [n(%)]

MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；AS：強(qiáng)直性脊柱炎
MTHFR：methylenetetrahydrofolate reductase；AS：ankylosing spondylitis

表2 AS組和正常對(duì)照組MTHFR C677T各基因型血漿同型半胱氨酸濃度的比較Table 2 Plasma homocysteine levels of MTHFR C677T genotypes in AS group and normal control

表3 MTHFR C677T基因多態(tài)性、血漿Hcy濃度、紅細(xì)胞葉酸濃度與基因組DNA甲基化水平的關(guān)系[M(95%CI)]Table 3 Correlations of MTHFR C677T gene polymorphism，plasma Hcy concentration，and erythrocyte folic acid concentration with genomic DNA methylation level [M(95%CI)]

與正常對(duì)照組比較，at=17.402，P<0.001；bt=16.166，P<0.001；ct=10.686，P<0.001；dt=5.655，P<0.001；與C677CC基因組比較，et=11.514，P<0.001；與C677CT基因組比較，ft=10.287，P<0.001
at=17.402，P<0.001；bt=16.166，P<0.001；ct=10.686，P<0.001；dt=5.655，P<0.001 compared with normal control group；et=11.514，P<0.001 compared with C677CC genetype group；ft=10.287，P<0.001 compared with C677CT genetype group

此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶MTHFR 677位點(diǎn)T/T基因型AS患者基因組DNA出現(xiàn)低甲基化，而且這種聯(lián)系與紅細(xì)胞葉酸水平無(wú)明顯相關(guān)。膳食葉酸來(lái)源、機(jī)體葉酸攝入量以及代謝過(guò)程均會(huì)影響DNA甲基化所需的甲基基團(tuán)供應(yīng)。充足的葉酸能提供足夠的甲基基團(tuán)用于DNA甲基化過(guò)程，如果葉酸攝入不足，則DNA合成與修復(fù)和甲基化過(guò)程均會(huì)受到影響，MTHFR基因多態(tài)導(dǎo)致酶活性下降，使得DNA甲基過(guò)程發(fā)生紊亂[13-15]。MTHFR基因多態(tài)對(duì)DNA甲基化的影響程度在不同葉酸和維生素B攝入量的情況下也有所不同。由于自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素共同參與的慢性過(guò)程，有關(guān)的研究有待進(jìn)一步深入。