曹 杰，楊人強

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南昌 330006

血小板在止血、血栓形成、免疫炎癥過程中起重要作用。血小板表達多種受體，這些都有助于血小板功能反應(yīng)。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫受體，可通過識別配體參與細胞的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)和血栓形成之間存在密切聯(lián)系。血小板可通過特定的受體識別循環(huán)中的病理配體，并將信號轉(zhuǎn)化為血栓形成前狀態(tài)。大量研究表明，血小板TLRs對血小板活化聚集及促進血栓形成有顯著的影響，本文總結(jié)了血小板中TLRs在血栓形成中的作用及與相關(guān)疾病的關(guān)系。

TLRs

TLRs是一種表達于單核細胞、巨噬細胞、血小板、樹突狀細胞和中性粒細胞等固有免疫細胞的模式識別受體，通過特異識別病原體上的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘發(fā)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)。TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白，可分為胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)3部分。胞膜外區(qū)由富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine rich repeat，LRR)組成，主要與配體識別有關(guān)。胞漿區(qū)因與白細胞介素1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)同源，稱為Toll/IL-1R受體結(jié)構(gòu)域(toll/IL-1R，TIR)。TIR結(jié)構(gòu)域高度保守，通過募集下游接頭分子決定TLR信號通路的特異性。跨膜區(qū)是一段富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，跨細胞膜連接TLR的胞膜外區(qū)與胞漿區(qū)。2004年，Shiraki等[1]首次通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)證實人血小板和Meg-01(巨核細胞株)表達TLRs家族。2005年，Andonegui等[2]首次證實人血小板表達功能性的TLR4。迄今為止，已在小鼠中發(fā)現(xiàn)13種TLRs(TLR1～13)，人類發(fā)現(xiàn)有11種TLRs(TLR1～11)。Koupenova等[3]發(fā)現(xiàn)人類血小板表達10種TLRs，并有性別差異，女性較男性表達更高的血小板TLRs。人血小板表達多種功能性TLRs，如TLR2、TLR4、TLR7和TLR9，其與血栓形成具有密切的聯(lián)系。

TLR2TLR2定位于細胞膜，是TLR家族中識別PAMPs最多的成員，可通過與TLR1或TLR6形成異質(zhì)二聚體識別配體。TLR2表達范圍最廣，可在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、內(nèi)皮細胞等表達。2009年，Blair等[4]首次證明人血小板能夠表達識別細菌成分的功能性TLR2，并能通過磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3-K)/絲氨酸蘇氨酸激酶(protein kinase B，Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活血小板和炎癥途徑形成血栓。Liu等[5]研究表明，B族鏈球菌通過血小板TLR2激活PI3-K/Akt，引發(fā)α顆粒的釋放和整合素GPⅡb/Ⅲa的活化，從而誘導(dǎo)血小板活化聚集。Biswas等[6]發(fā)現(xiàn)羧基烷基吡咯-磷脂酰乙醇胺衍生物(carboxyalkylpyrrole-phosphatidylethanolamine derivatives，CAP-Pes)，一種氧化修飾的磷脂，也可通過血小板TLR2激活血小板促進血栓形成。他們還在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，氧化磷脂oxPCCD36結(jié)合血小板CD36，誘導(dǎo)CD36與TLR2/TLR6形成復(fù)合物，激活血小板加速血栓形成，表明血小板TLR2在血小板高反應(yīng)性和高脂血癥引起的促血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。然而Assinger 等[8]發(fā)現(xiàn)，人巨細胞病毒可通過血小板TLR2誘導(dǎo)血小板激活，促進血小板白細胞聚集、炎癥和血管生成，從而加劇組織損傷，促進動脈粥樣硬化形成，不引起血小板黏附和聚集形成血栓，與上述研究有別。

TLR4TLR4是發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣泛的TLR，定位于細胞膜上。TLR4可識別革蘭陰性細菌產(chǎn)生的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、內(nèi)源性配體如組蛋白、高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)、熱休克蛋白和脂磷壁酸等。2005年，Andonegui等[2]首次報道人血小板表達功能性的TLR4，且血小板TLR4介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的循環(huán)血小板減少和肺中血小板聚集。隨后有研究發(fā)現(xiàn)，在嚴重的全身感染時，血小板通過TLR4與中性粒細胞緊密結(jié)合，快速形成嗜中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NET)，NET在流動條件下保持其完整性并在脈管系統(tǒng)內(nèi)誘捕細菌，但這種抗菌作用是以損傷內(nèi)皮和組織為代價[9]。Fuchs等[10]發(fā)現(xiàn)，NET為血小板聚集提供刺激和支架，可促進血栓形成。組蛋白是NET的主要成分，通過血小板依賴性機制誘導(dǎo)凝血酶生成促進血栓形成，且血小板TLR2和TLR4參與組蛋白誘導(dǎo)的血小板活化[11-12]。研究還發(fā)現(xiàn)，血小板衍生的HMGB1是形成血栓的關(guān)鍵介質(zhì)，而HMGB1可通過血小板TLR4促進血小板聚集和血栓形成[13]。此外血小板TLR4還可以介導(dǎo)含有額外結(jié)構(gòu)域A的細胞纖連蛋白(cellular fibronectin containing extra domain A，F(xiàn)n-EDA+)[14]、血小板Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)[15-16]炎性小體，導(dǎo)致血小板活化聚集促進血栓形成。

TLR7TLR7定位于細胞內(nèi)，主要識別病毒單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)。2014年，Koupenova等[17]首次報道血小板表達功能性的TLR7，且血小板中TLR7的激活在介導(dǎo)血小板-病毒免疫應(yīng)答是必需的。病毒感染的早期階段，血小板TLR7的激活可直接導(dǎo)致血小板計數(shù)減少，并影響病毒感染宿主的存活，然而血小板TLR7的激活不會誘導(dǎo)血小板聚集，盡管血小板TLR7的激活增加了血小板對膠原的黏附，但其并不促進血栓形成，對血栓形成沒有直接影響，這與其他TLRs受體有別。

TLR9TLR9定位于細胞內(nèi)，可在靜止的人血小板質(zhì)膜和細胞質(zhì)中表達，且在用凝血酶激活血小板后表達增加。血小板活化后血小板分泌增強，釋放的蛋白產(chǎn)物協(xié)調(diào)動態(tài)免疫和炎癥應(yīng)答。而血小板分泌的蛋白質(zhì)大部分最初被認為儲存在3種類型的儲存細胞器中：α顆粒、致密體和溶酶體。最近Thon等[18]發(fā)現(xiàn)了第4個稱為T顆粒的電子致密管狀系統(tǒng)隔室，有趣的是TLR9和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶共定位在T顆粒。Panigrahi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，羧基(烷基吡咯)蛋白加合物，[carboxy(alkylpyrrole)proteins，CAPs]，一種氧化應(yīng)激產(chǎn)生的配體，可作為TLR9的新配體，CAPs通過TLR9/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)途徑誘導(dǎo)血小板活化、顆粒分泌，促進血小板體外聚集以及體內(nèi)血栓形成，表明血小板TLR9是一種功能性血小板受體，其可將氧化應(yīng)激、血栓形成和先天免疫聯(lián)系起來。

血小板TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

TLRs識別PAMPs后，TIR募集特定的接頭分子激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，引發(fā)免疫反應(yīng)。在有核細胞中，TLRs主要有兩個不同的信號通路：MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑。MyD88依賴途徑：TLR識別配體后發(fā)生二聚化，募集接頭分子MyD88，MyD88與絲/蘇氨酸蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)家族結(jié)合，導(dǎo)致IRAK自身磷酸化，磷酸化的IRAK脫離MyD88與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6)結(jié)合，使轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)活化酶1(TGF-β activated kinase 1，TAK1)激活。TAK1激活后有兩條不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；(1)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑；(2)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MyD88非依賴途徑：MyD88非依賴途徑主要由TLRs相關(guān)的干擾素活化因子(TIR domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF)介導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素和炎性細胞因子。

然而有研究表明，血小板也表達NF-κB[20]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是血小板活化的介質(zhì)，且NF-κB是TLR2和TLR4介導(dǎo)血小板效應(yīng)的關(guān)鍵下游介質(zhì)[21-23]。Berthet等[24]研究發(fā)現(xiàn)，血小板表達TLRs在有核細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的大多數(shù)分子，如MyD88、TRIF、IRAK-1、MAPk、TRAF6和NF-κB等。Zhang等[25]研究也表明，血小板表達LPS受體-信號傳導(dǎo)復(fù)合物的必要成分包括TLR4、髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD2)和MyD88，且LPS可通過TLR4/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物刺激血小板分泌和聚集。上述研究表明，血小板含有有核細胞通過TLRs進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的大部分蛋白質(zhì)，似乎血小板與有核細胞具有相同的機制，但情況并非如此。因為MyD88依賴和MyD88非依賴途徑最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活和核轉(zhuǎn)位，而血小板是無核細胞，基因轉(zhuǎn)錄是不可實現(xiàn)的。TLRs如何在血小板進行信號傳導(dǎo)，其機制仍未完全闡明。在無核血小板中，TLRs還存在其他信號傳導(dǎo)途徑。Hazeki等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TLRs在多種免疫細胞中可激活PI3-K/Akt信號通路。而在血小板中，PI3-K/Akt通路可廣泛調(diào)節(jié)血小板功能，包括血小板黏附、分泌和聚集[27]。Blair等[4]研究證實，TLR2可激活人血小板中PI3-K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，而PI3-K/Akt能調(diào)節(jié)TLR2介導(dǎo)的血小板功能反應(yīng)，包括血小板聚集、黏附、分泌、白細胞相互作用和活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生。F?lker等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2/1復(fù)合物激活劑Pam3CSK4通過Src和Syk家族的酪氨酸激酶，活化T細胞接頭蛋白(linker for activating T cell，LAT)以及磷脂酶 Cγ2(phospholipase C isoform γ2，PLCγ2)引起人血小板的活化和聚集。Zhang等[25]研究證實，LPS通過TLR4-MyD88和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)/cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)途徑，刺激血小板顆粒分泌，導(dǎo)致血小板活化和聚集增強。Vogel等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，血小板TLR4可通過cGMP依賴性蛋白激酶 Ⅰ(cGMP-dependent protein kinase Ⅰ，cGKⅠ)途徑介導(dǎo)血小板活化和聚集。LPS通過TLR4-PI3K/Akt-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)-磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)增加人血小板活化，該途徑依賴于ROS和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的形成[29]。CAPs作為TLR9的新配體，可通過TLR9/MyD88/IRAK1信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)血小板活化，PI3-K/Akt和Src家族激酶也參與其中[19]。上述研究表明，血小板TLRs可通過多種信號途徑調(diào)控血小板功能，促進血栓形成，但其機制尚不完全清楚，仍有待進一步研究。

血小板TLRs與血栓性疾病的關(guān)系

膿毒癥膿毒癥是繼發(fā)于感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，凝血功能紊亂是膿毒癥重要的發(fā)病機制，而由凝血異常導(dǎo)致的血栓是膿毒癥的常見并發(fā)癥。Stark等[30]研究表明，血小板的TLR4足以促進內(nèi)毒素血癥中的微血管血栓形成，然而其并不伴有全身性炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)-1β的增加，促血栓形成和炎性細胞因子的解離為血小板TLR4的作用機制提供了新見解。HMGB1是一種內(nèi)源性損傷相關(guān)模式分子，在凝血異常疾病的發(fā)病中至關(guān)重要。Vogel等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生的HMGB1是血栓形成的關(guān)鍵介質(zhì)，活化血小板釋放的HMGB1通過血小板TLR4/MyD88和鳥苷酸環(huán)化酶(GC：第二信使cGMP的NO信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵酶)形成MyD88/GC復(fù)合物，誘導(dǎo)血小板中的cGK1，從而介導(dǎo)血栓形成和血小板聚集。最近研究發(fā)現(xiàn)，細胞外組蛋白在膿毒癥發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用，組蛋白具有促進血液凝固和凝血酶形成的能力，膿毒癥時免疫細胞激活釋放NETs、細胞壞死均可導(dǎo)致細胞外組蛋白濃度升高。而Xu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白是膿毒癥患者死亡的主要介導(dǎo)者，其介導(dǎo)了凝血功能紊亂。Semeraro等[12]研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白可通過血小板依賴性機制直接促進凝血和凝血酶形成，進而影響膿毒癥血栓形成，且血小板TLR2和TLR4參與其中。這些研究表明，血小板的TLRs可直接或間接參與膿毒癥血栓的發(fā)生發(fā)展。

急性冠脈綜合征Gurses等[32]首次報道急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者血小板的TLR2和TLR4表達增加，且通過TLRs的自身配體可引起血小板活化，這可能導(dǎo)致ACS患者的促血栓狀態(tài)形成。Hally等[33]也發(fā)現(xiàn)，在ACS患者中血小板TLR9的表達增加。Hally等[34]隨后在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者中也發(fā)現(xiàn)血小板TLR1和TLR4表達上調(diào)，且血小板TLR2/1復(fù)合物能夠直接以劑量依賴性地誘導(dǎo)血小板活化，表明血小板TLR2/1復(fù)合物可能是AMI中的替代血小板激活途徑。進一步研究表明，阿司匹林和替格瑞洛的聯(lián)合抗血小板治療不能完全抑制TLR激動劑引起的血小板活化，表明目前的抗血小板治療不能完全抑制血小板TLRs引起的血小板活化，血小板TLRs通路可能是抗血小板治療后的替代性血小板激活途徑，有助于AMI患者發(fā)生再發(fā)缺血性心血管事件[35]。以上研究表明，血小板TLRs與急性冠脈綜合征的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。

綜上所述，血小板表達多種功能性TLRs，其參與并介導(dǎo)血小板的功能反應(yīng)，進而影響血栓形成，在血栓相關(guān)的疾病中扮演重要角色。然而血小板TLRs的作用機制尚未完全闡明，雖然血小板表達有核細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號蛋白，但其是否有功能尚未闡明。深入了解血小板TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能更好地理解TLRs在血小板功能的作用，血小板TLRs及其信號通路可能成為治療血栓性疾病的新靶標(biāo)。