王 嵐，張 宏，李靖靖*

(1．鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044；2.南陽市南召縣辛夷產(chǎn)業(yè)辦公室，河南 南陽 474650)

辛夷是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材之一，其性溫、味辛，具有祛風(fēng)散寒、開穴通竅之功能，在我國(guó)已有兩千多年的臨床應(yīng)用歷史[1]。辛夷的采集主要集中在花蕾部位，對(duì)其有性繁殖產(chǎn)生較大影響。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)辛夷的需求增加，市場(chǎng)前景十分廣闊，但缺乏利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性的研究，種質(zhì)資源的多樣性受到嚴(yán)峻考驗(yàn)，如何保證辛夷的可持續(xù)發(fā)展是未來面臨的一個(gè)重要問題[2]。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和檢測(cè)技術(shù)的日益完善，從DNA水平上對(duì)品種的遺傳特異性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、不受季節(jié)或外環(huán)境影響的鑒定成為可能，可為道地品種保護(hù)提供理論基礎(chǔ)和法律依據(jù)。本研究旨在篩選出辛夷序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP)分子標(biāo)記的引物，為河南辛夷的道地性品牌提供分子學(xué)基礎(chǔ)。

1 文獻(xiàn)綜述

辛夷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3]，是我國(guó)民間常用的中藥材，具有抗炎、抗過敏作用[4]。辛夷在我國(guó)已有兩千多年的臨床應(yīng)用歷史，其性溫、味辛，具有祛風(fēng)散寒、開穴通竅之功能，臨床上主要用于抗炎、抗病毒治療。辛夷多為栽培，少有野生，藥用原植物較多，種類多樣。辛夷富含芳香類物質(zhì)，其中揮發(fā)油含量高達(dá)3%～4%，主要成分為松油二環(huán)烯、桉精油等，是輕化行業(yè)和食品行業(yè)重要的添加劑。此外，辛夷樹種根系發(fā)達(dá)，耐干耐寒，生長(zhǎng)迅速、樹形及樹冠美觀，花色鮮艷，也是重要的速生和綠化樹種。辛夷是我國(guó)傳統(tǒng)的出口商品，近些年，國(guó)內(nèi)外對(duì)辛夷的需求量日益增加，辛夷價(jià)格不斷攀升，市場(chǎng)開發(fā)前景十分廣闊。作為辛夷的原產(chǎn)國(guó)，其植株主要分布于河南、湖北、陜西及四川等省。河南省南召縣位于伏牛山東段南麓，長(zhǎng)江流域漢水上游，是河南省山區(qū)林業(yè)重點(diǎn)縣之一。南召辛夷具有綠色、無污染、道地性好，藥用價(jià)值高，用途范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。南召栽培辛夷的歷史悠久，《本草綱目》上對(duì)南召辛夷曾有詳細(xì)記載，把南召辛夷列為“本經(jīng)上品”；《河南省志》第五十八卷記載，辛夷花應(yīng)用始于元末明初，以南召所產(chǎn)之地最佳；1977 年南召辛夷被《中華人民共和國(guó)藥典》列為正品，在國(guó)際市場(chǎng)上素有“南召辛夷不驗(yàn)貨”的嘉譽(yù)。2001年3月，原國(guó)家林業(yè)局和中國(guó)經(jīng)濟(jì)林協(xié)會(huì)將南召縣作為首批命名的全國(guó)唯一“中國(guó)辛夷之鄉(xiāng)”；2003 年，南召辛夷及其制品獲得原國(guó)家質(zhì)檢總局原產(chǎn)地保護(hù)注冊(cè)認(rèn)證。南召縣栽培辛夷的歷史悠久，為歷史上辛夷的原產(chǎn)地，但目前市場(chǎng)品系混亂，真?zhèn)坞y辨，嚴(yán)重影響辛夷藥品質(zhì)量及道地藥材的品牌效應(yīng)[2]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)以辛夷種質(zhì)資源為研究對(duì)象的報(bào)道不多，且辛夷的研究主要集中于化學(xué)成分分析、臨床應(yīng)用、栽培技術(shù)、品種選育、種屬分類等方面[2,5-6]，利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性研究的報(bào)道甚少，僅見郭樂等[7]利用ISSR 標(biāo)記對(duì)野生望春玉蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行過比較分析，這對(duì)于人工栽培的辛夷種質(zhì)資源多樣性研究和種質(zhì)鑒定而言，提供的分子水平的理論依據(jù)不夠充分，也無法為“河南辛夷”道地性品牌的保護(hù)提供有力的支撐。

利用DNA 分子標(biāo)記能科學(xué)準(zhǔn)確地鑒定植物品種以及種質(zhì)資源材料的遺傳特性，對(duì)遺傳資源保護(hù)和利用、遺傳資源評(píng)價(jià)、種子質(zhì)量鑒定和道地性品牌權(quán)益保護(hù)具有重要意義[8]。目前已經(jīng)建立的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有十多種, 但每種方法的復(fù)雜性、可靠性均不相同。SRAP分子標(biāo)記是分析植物材料遺傳背景的有力工具，它通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的開放式閱讀框特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。趙秀娟等[9]利用SRAP篩選標(biāo)記研究43份苦瓜的遺傳多樣性表明：平均每對(duì)引物擴(kuò)增可得到14.15條多態(tài)性譜帶，多態(tài)性位點(diǎn)42.11%。SRAP分子標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、可顯示大量的共顯性標(biāo)記、易從序列中得到分離的條帶等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳學(xué)和育種學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，目前已在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于各類農(nóng)作物、中藥材等的種質(zhì)資源多樣性研究領(lǐng)域[10]。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

采取河南省南召縣辛夷樹種盛花期的花蕾，共34個(gè)個(gè)體，由河南省南陽市南召縣辛夷產(chǎn)業(yè)辦公室張宏提供 (見表1)，采摘后用自封袋封裝，-70℃冰箱凍存。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DP305植物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop 2000C 微量分光光度計(jì)：美國(guó)NanoDrop 公司；Tanon1600凝膠圖像處理系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。

表1 河南辛夷編號(hào)及品種名稱

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 DNA提取及檢測(cè)

每個(gè)品種稱取70～100mg移入研缽，加入少量石英砂，研磨成細(xì)粉末狀。將粉末加入2.0mL離心管中，應(yīng)用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根，DP305)，嚴(yán)格按照說明書步驟提取DNA。用微量分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop 2000C)測(cè)定DNA的OD值及A260/280值，分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，-70℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。

2.3.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系及檢測(cè)

參考2001年由LI和QUIROS[11]創(chuàng)建的SRAP方法，并對(duì)擴(kuò)增體系和程序進(jìn)行優(yōu)化。正反向引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(見表2)。通過正反向引物正交實(shí)驗(yàn)，組成36對(duì)SRAP引物組合，對(duì)34個(gè)辛夷品種進(jìn)行初篩。 PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，其中2.5μL 10×PCR buffer(含MgCl2)，1μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，正反向引物各1 μL，模板DNA 30ng，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，余雙蒸水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 變性1 min,35℃退火1min,72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸5min，35個(gè)循環(huán)；4℃保存。在含有核酸染料的1.8%瓊脂糖凝膠，電極緩沖液為0.5×TBE,110 V電壓下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,電泳后用 Tanon1600(上海天能)凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

表2 SRAP所用引物序列(5’- 3’)

2.3.3 優(yōu)化體系的驗(yàn)證

利用優(yōu)化好的SRAP反應(yīng)體系，對(duì)34個(gè)河南辛夷品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析多態(tài)性。

3 結(jié)果

3.1 河南辛夷基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，所有樣品的DNA A260/280值在1.7～1.9，材料的基因組DNA質(zhì)量和濃度都較高，滿足本試驗(yàn)的要求。

3.2 引物的篩選

3.2.1 初篩

將34個(gè)河南辛夷品種的DNA各取1ul，作為混合DNA，對(duì)所有的引物組合進(jìn)行初篩 (圖1A)，初步篩選出10對(duì)引物組合。

3.2.2 復(fù)篩

在初篩的基礎(chǔ)上，對(duì)選出來的10對(duì)引物組合用34個(gè)辛夷品種進(jìn)行復(fù)篩(圖1B)，共篩選出8對(duì)引物組合 (見表3)，滿足背景干凈、條帶清晰、擴(kuò)增條帶豐富的條件，可用于深入的研究。

圖1 SARP部分引物的初篩和復(fù)篩

3.3 河南辛夷多態(tài)性分析

應(yīng)用篩選出的8對(duì)引物對(duì)34個(gè)河南辛夷品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出107條譜帶，83條多態(tài)性譜帶，其中多態(tài)性比例為77.57%。每個(gè)引物組合的擴(kuò)增條帶為11～17(表3)，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在100～2000bp。

表3 復(fù)篩的SRAP引物組合序列(5’- 3’)及擴(kuò)增結(jié)果

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記對(duì)河南省南召縣的34個(gè)辛夷品種進(jìn)行了研究，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，最終選出8對(duì)背景干凈、條帶清晰、擴(kuò)增條帶豐富的引物組合，并進(jìn)行辛夷多態(tài)性分析，共擴(kuò)增出107條譜帶，83條多態(tài)性譜帶，其中多態(tài)性比例為77.57%，為今后河南辛夷在SRAP分子標(biāo)記方面的研究提供依據(jù)，且能滿足對(duì)辛夷的多態(tài)性分析、聚類分析等。為辛夷品種分類鑒別、種群進(jìn)化潛力、優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保護(hù)和選育提供可靠的分子學(xué)證據(jù)，對(duì)從源頭保障“河南辛夷” 藥材道地性具有重要現(xiàn)實(shí)意義，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。