周興婷，于雷雷，翟齊嘯，田豐偉，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

腸道菌群作為人體組成的一個(gè)重要部分，發(fā)揮著重要而又特殊的營養(yǎng)代謝和腸道屏障保護(hù)功能。近年來，越來越多的研究表明2型糖尿病的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)有著密切的關(guān)系。腸道菌群在宿主體內(nèi)具有與病原體競(jìng)爭(zhēng)性定殖、發(fā)展免疫系統(tǒng)和腸道屏障系統(tǒng)的功能[1]。腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降、慢性炎癥反應(yīng)和能量代謝失衡等一系列并發(fā)癥，這些會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致代謝紊亂和胰島素抵抗[2]，最終形成2型糖尿病。2型糖尿病是以胰島素抵抗、葡萄糖耐量降低和低度炎癥引發(fā)的以高血糖為特征的代謝紊亂癥之一[3]。國際衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)2025年糖尿病患者數(shù)量將突破3億，而中國是世界上糖尿病患者數(shù)居第2的國家，主要以2型糖尿病為主[4]，目前大量研究表明，2型糖尿病會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門豐度上升[5]。對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)成為當(dāng)前的一種干預(yù)和治療2型糖尿病的新策略。腸道菌群的可塑性將發(fā)展為一種很有前途的治療手段[6]。乳酸菌屬于益生菌的種類之一，近些年對(duì)乳酸菌的研究日益增多，益生菌由于其益生性和安全性已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵食品，且乳酸菌對(duì)改善2型糖尿病的癥狀具有顯著的效果，鼠李糖乳桿菌CRL981能夠顯著緩解高血糖水平，調(diào)節(jié)機(jī)體血脂水平和抗氧化酶的活力[7]。富鉻酵母產(chǎn)品具有很好的降糖效果，能夠顯著緩解糖尿病相關(guān)癥狀，因其效果顯著和安全性高的特點(diǎn)在市場(chǎng)上被廣泛應(yīng)用于糖尿病人群的飲食干預(yù)。鉻參與糖代謝，調(diào)控胰島素功能，從而發(fā)揮降糖效果。本文通過研究2株具有顯著降糖效果的乳桿菌，植物乳桿菌X1和鼠李糖乳桿菌CCFM0528與富鉻酵母進(jìn)行復(fù)配組合，應(yīng)用于2型糖尿病小鼠模型中，探究其復(fù)配劑是否具有協(xié)同增效的作用，其緩解機(jī)制是否涉及調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)。本研究的成果將為益生菌復(fù)配劑應(yīng)用于2型糖尿病的干預(yù)治療提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

植物乳桿菌(X1)、鼠李糖乳桿菌(CCFM0528)，江南大學(xué)食品生物中心菌種保藏中心；富鉻酵母，安琪酵母股份有限公司；鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)，sigma公司；基因組提取試劑盒Fast DNA?SPIN Kit for Feces，美國MP公司；DNA回收試劑盒TIANgel Mini Purification Kit，天根生化科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、無水葡萄糖、無水乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4、檸檬酸氫二鈉、K2HPO4·3H2O、吐溫80、乙酸、丙酸和丁酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小型冷凍離心機(jī)，德國Hettich有限公司；大容量冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；隔水式恒溫生物培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1CV型微生物操作超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；EL204型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，島津中國公司；PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；MiSeq測(cè)序儀，美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳桿菌的活化與培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱中取出乳桿菌的保菌管，在乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS) 固體平板上劃線，挑出單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基后于37 ℃培養(yǎng)18 h，之后以1%～2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中在37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化3代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 益生菌復(fù)配劑的制備

將活化菌株按1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于1 L的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)下培養(yǎng)18 h后，在4 ℃，6 000 r/min的條件下離心10 min后獲得菌泥，無菌生理鹽水沖洗3次，用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂乳作為保護(hù)劑重懸，冷凍干燥后，與富鉻酵母進(jìn)行復(fù)配，其中小鼠每日攝入每種乳桿菌含量為109CFU，富鉻酵母按小鼠每日鉻攝入量100 μg/kg為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)配。小鼠灌胃之前，用無菌生理鹽水重懸調(diào)整菌液濃度為5×109CFU/mL，富硒酵母為5 mg/mL，并在37 ℃水浴中復(fù)蘇30 min后使用。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 益生菌復(fù)配劑的降糖效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

選取50只體重相近的3周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，喂養(yǎng)程序經(jīng)江南大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的許可(許可證號(hào)：JN.No 20180115c0700613[24])。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房常年恒溫恒濕，保持溫度在(22±2)℃和濕度在(55±5)%的范圍內(nèi)，并嚴(yán)格遵循12 h晝夜循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，喂食普通飼料，1周后隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、藥物組、乳酸菌組、復(fù)合組。分組后前5周實(shí)驗(yàn)期間，正常組喂食普通飼料，其余各組喂食高脂飼料，同時(shí)正常組、模型組、藥物組灌胃脫脂乳，乳酸菌組喂食混合乳酸菌溶液、復(fù)合組喂食益生菌復(fù)配劑。第5周，所有小鼠禁食8 h以上，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠注射新鮮的鏈脲佐菌素STZ(按100 mg/kg體重注射)。造模1周后，所有小鼠開始喂食普通飼料，同時(shí)正常組和模型組灌胃脫脂乳，藥物組開始灌胃鹽酸二甲雙胍(按10 mg/kg體重灌胃)，乳酸菌組喂食混合乳酸菌溶液、復(fù)合組喂食益生菌復(fù)配劑。

1.3.3.2 小鼠糞便腸道菌群的測(cè)定[8]

在收集小鼠糞便之后，準(zhǔn)確稱量500 mg的小鼠糞便樣品，利用Fast DNA?SPIN Kit for Feces試劑盒提取糞便樣品中的DNA。以提取到的DNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增16S rDNA的V3、V4區(qū)。PCR體系為50 μL，上游引物341 R，下游引物806 R。擴(kuò)增結(jié)束之后，制作瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳，利用電泳操作來進(jìn)行DNA條帶的分離，對(duì)條帶亮區(qū)進(jìn)行切膠回收，將得到的DNA利用Qubit 3.0測(cè)定樣品的DNA濃度，然后經(jīng)Illumina MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。上機(jī)測(cè)定完成之后，獲得下機(jī)數(shù)據(jù)地址，根據(jù)bacode表篩選出正確的樣品標(biāo)簽，制定出Mapping_File文件，利用SSH Secure Shell Client軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取和合并。去除嵌合體序列，進(jìn)行OTU聚類，選取OTU代表性序列以進(jìn)行后續(xù)分析。通過對(duì)序列進(jìn)行分類，制定biom格式的OTU表。隨后將otu_table.biom文件轉(zhuǎn)換可讀的OTU_table.txt文件，根據(jù)otu_table.biom進(jìn)行α、β多樣性分析和腸道菌群門屬水平種類與豐度的多樣性分析。

1.3.3.3 小鼠糞便短鏈脂肪酸的測(cè)定[8]

收集糞便之后，放在凍干平板上進(jìn)行凍干處理脫去水分之后，準(zhǔn)確稱取50 mg樣品放入500 μL飽和NaCl溶液中進(jìn)行破碎處理，然后加入20 μL H2SO4溶液進(jìn)行酸化處理，處理完之后加入1 mL乙醚溶液進(jìn)行短鏈脂肪酸的提取，將上清液倒入無水Na2SO4固體中進(jìn)行脫水處理，樣品制備完成后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)來檢測(cè)小鼠糞便中的乙酸、丙酸、丁酸中的表達(dá)量。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用One-way ANOVA分析，作圖采用Graphpad 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠腸道菌群α多樣性和β多樣性分析

為了研究乳酸菌與富鉻酵母的復(fù)配是否對(duì)糖尿病小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用，通過16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序的方法來分析小鼠糞便中腸道菌群的組成與豐度，分析不同組別間小鼠菌群的α多樣性和β多樣性，α多樣性和β多樣性一起構(gòu)成了小鼠菌群的總體多樣性或一定區(qū)域的生物異質(zhì)性。Chao1指數(shù)反映了小鼠糞便菌群的豐富性，Shannon指數(shù)反映了小鼠糞便菌群的多樣性。結(jié)果如圖1-A所示，造模組小鼠菌群豐富度明顯下降，這與IN KIELER等[9]的研究結(jié)果一致；如圖1-B所示，各組小鼠Shannon指數(shù)并沒有顯著性差異，這說明各組小鼠之間菌群多樣性沒有顯著差異，這與HAN等[10]的研究結(jié)果一致。圖1-C結(jié)果顯示模型組集中在PCA圖的右下角，藥物組、乳酸菌組、復(fù)合組與空白組聚集混合在一起，集中在PCA圖中上方，這說明糖尿病會(huì)引起小鼠腸道菌群發(fā)生改變，不同的干預(yù)治療方式會(huì)帶來不同程度菌群結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

A-菌群豐富度；B-shannon指數(shù)；C-主成分分析圖1 不同組別小鼠糞便菌群的α多樣性、β多樣性Fig.1 Alpha diversity, beta diversity of gut microbiota in different groups of mice注：#代表與空白組比較有顯著差異，P<0.05；*代表與造模組比較有顯著差異，P<0.05。下同。

2.2 小鼠腸道菌群門水平上菌群變化

如圖2所示，小鼠糞便菌群在門水平上，主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia) 和變形菌門(Proteobacteria) 組成。圖2結(jié)果顯示，經(jīng)STZ造模后的糖尿病小鼠在門水平上，F(xiàn)irmicutes豐度明顯上升，Bacteroidetes豐度明顯下降(P<0.05)，這與CAO等[11]的研究結(jié)果相一致。

圖2 不同組別小鼠腸道菌群的門水平豐度Fig.2 The phylum level of gut microbiota in different groups of mice

Firmicutes和Bacteroidetes是腸道菌群門水平上最主要的組成成分，相對(duì)豐度達(dá)到70%～90%，腸道內(nèi)Firmicutes與Bacteroidetes的比例增大時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體更加有效地吸收食物中的熱量，從而導(dǎo)致肥胖，研究表明肥胖導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，是誘發(fā)2型糖尿病的原因之一。在實(shí)驗(yàn)前期通過喂食高脂飼料來誘導(dǎo)糖尿病模型，如圖3所示。

A-擬桿菌門；B-厚壁菌門圖3 不同組別小鼠糞便菌群的Bacteroidetes和Firmicute豐度Fig.3 Bacteroidetes and Firmicute abundance of gut microbiota in different groups of mice

模型組小鼠Bacteroidetes明顯下降，F(xiàn)irmicutes明顯上升，而經(jīng)過治療后，藥物組、乳酸菌組和復(fù)合組的Bacteroidetes和Firmicute的相對(duì)豐度均有所恢復(fù)，這說明藥物組發(fā)揮了一定的緩解效果，乳酸菌組和復(fù)合組的結(jié)果顯示，二者均能夠顯著回調(diào)Bacteroidetes和Firmicute的豐度，一定程度緩解2型糖尿病導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)。

2.3 小鼠腸道菌群屬水平上的差異

從門水平上進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型會(huì)導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生紊亂，為了進(jìn)一步探究2型糖尿病在屬水平上的差異，利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)一步分析屬水平上菌群的相對(duì)豐度。如圖4所示，小鼠菌群在厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、多爾氏菌屬(Dorea)、理研菌屬(Rikenellaceae-g_)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Akk菌屬(Akkermansia) 等水平上發(fā)生了明顯改變。

圖4 不同組別小鼠腸道菌群的屬水平豐度Fig.4 Genus abundance of gut microbiota in different groups of mice

如圖5-A所示，與空白組相比，在屬水平上，模型組中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Akk菌屬(Akkermansia) 和瘤胃球菌屬(Ruminococcus) 豐度明顯減少(P<0.05)，經(jīng)過干預(yù)治療后，復(fù)合組小鼠Bifidobacterium、Lactobacillus和Akkermansia菌群豐度均有明顯回升(P<0.05)，但是Ruminococcus豐度增加但是沒有顯著性差異。

Bifidobacterium和Lactobacillus是一類居住在腸道內(nèi)并發(fā)揮多種益生作用的微生物，它們可以維護(hù)人體健康和調(diào)節(jié)免疫功能，部分菌株可以有效抑制血糖的增長，達(dá)到緩解2型糖尿病的效果[12]。研究發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium的豐度與腸道內(nèi)毒素水平存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[13]，內(nèi)毒素可以激活TLR4 /MyD88/NF-κB途徑，釋放炎癥因子，導(dǎo)致細(xì)胞胰島素抵抗(IR)。糖尿病小鼠由于機(jī)體炎癥水平導(dǎo)致雙歧桿菌豐度下降，而經(jīng)過干預(yù)處理后，其豐度有所回升。Lactobacillus可以抑制誘導(dǎo)自身免疫性糖尿病的CD4+T細(xì)胞和細(xì)胞因子(IL-2) 的產(chǎn)生，同時(shí)可以抑制胰島β細(xì)胞的自身免疫性破壞[14]。胰島β細(xì)胞的破壞加劇了2型糖尿病的癥狀，在經(jīng)過乳桿菌干預(yù)治療后，可以明顯改善機(jī)體2型糖尿病的病癥。Ruminococcus[15]是一類革蘭氏陽性厭氧菌，是發(fā)酵產(chǎn)生丁酸的腸道微生物主要成員之一，丁酸是碳水化合物和脂肪代謝途徑的核心，通過影響短鏈脂肪酸的含量來影響2型糖尿病患者的血糖水平。Akkermansia[16]是人體腸道中一種可降解黏蛋白的細(xì)菌，它與肥胖、糖尿病、炎癥和代謝紊亂呈負(fù)相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Akkermansia可以顯著增強(qiáng)機(jī)體的葡萄糖耐受性并減弱脂肪組織炎癥。2型糖尿病小鼠葡萄糖耐受性明顯下降且伴隨組織炎癥[17]，造模后導(dǎo)致模型組小鼠Akkermansia豐度明顯下降，而喂食乳酸菌和富鉻酵母能夠明顯增加了Akkermansia屬豐度。說明喂食乳酸菌和富鉻酵母能夠在一定程度緩解2型糖尿病造成的腸道菌群紊亂。

與空白組相比，在屬水平上，模型組厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、糞球菌屬(Coprococcus)、多爾氏菌屬(Dorea)、理研菌屬(Rikenellaceae-g_) 明顯增多(P<0.05)。經(jīng)過干預(yù)治療后，復(fù)合組能夠顯著降低Anaerostipes、Coprococcus和Rikenellaceae-g_菌群豐度(P<0.05)。

Anaerostipes[18]是一類革蘭氏陽性致病菌，其致病物質(zhì)主要是外毒素，可引起局部炎癥，當(dāng)外毒素入血后引起全身中毒癥狀，常損傷心肌與外周神經(jīng)，Anaerostipes與2型糖尿病宿主機(jī)體炎癥水平息息相關(guān)。Coprococcus[19]是一類革蘭氏陽性厭氧菌，與腸道健康、胃腸道功能和炎癥水平息息相關(guān)。Dorea[20]是腸道中主要的產(chǎn)氣菌，利用碳水化合物產(chǎn)氣，與腸易激綜合征有關(guān)。Rikenellaceae[21]是一類存在于腸道內(nèi)的致病菌，與艾滋病、胃癌和炎性腸病等疾病的發(fā)生息息相關(guān)。Anaerostipes、Coprococcus和Rikenellaceae是腸道內(nèi)存在的致病菌，能夠加劇機(jī)體炎癥水平，其致病物質(zhì)內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)通過TLR4/MyD88/NF-κB等途徑在機(jī)體內(nèi)釋放炎癥因子，導(dǎo)致機(jī)體炎癥，破壞機(jī)體健康狀態(tài)，胰島β細(xì)胞被破壞，誘導(dǎo)2型糖尿病的形成，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致一系列并發(fā)癥的發(fā)生，如炎癥性腸病。2型糖尿病小鼠腸道穩(wěn)態(tài)遭到破壞，其致病菌的豐度升高，進(jìn)一步加劇了腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)。

A-雙歧桿菌屬；B-乳桿菌屬；C-Akk菌屬；D-壓氧棒球菌屬；E-類球菌屬；F-瘤胃球菌屬；G-多爾氏菌屬；H-理研菌屬；I-分類■理研圖5 不同組別小鼠腸道菌群的不同菌屬豐度Fig.5 Different species abundance of gut microbiota in different groups of mice

2.4 造模組和復(fù)合組間菌群差異分析

對(duì)小鼠糞便門水平和屬水平上菌群豐度的分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)配配方能夠在一定程度緩解2型糖尿病造成的腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)的癥狀，利用LEfse分析對(duì)模型組和復(fù)合組2組之間進(jìn)行比較，進(jìn)行亞組分析，從而找到這2組間在豐度上具有顯著差異的物種，分析結(jié)果如圖6所示。

圖6 造模組和復(fù)合組的進(jìn)化分支圖和LDA值分布柱狀圖Fig.6 Model and cocktail group evolutionary branch diagram and LDA score diagram

模型組小鼠厚壁菌門(Firmicutes)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichi) 存在顯著差異，且厚壁菌門(Firmicutes)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichi)、咸海鮮球菌(Jeotgalicoccus)、副桿菌屬(parabacteroides) 和支原菌屬(Allobaculum) 豐度上明顯增加。復(fù)合組小鼠擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria) 和放線菌綱(Actinobacteria) 存在顯著差異，且擬桿菌門(Bacteroidetes)、Akk菌屬(Akkermansia) 和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 豐度上明顯增加。

2.5 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量結(jié)果

短鏈脂肪酸與2型糖尿病之間有著密切關(guān)系，短鏈脂肪酸是由某些腸道菌群通過復(fù)雜的多糖發(fā)酵產(chǎn)生，主要以乙酸、丙酸和丁酸為主，在能量代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂肪生成調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[22]。糖尿病會(huì)導(dǎo)致短鏈脂肪酸水平降低并改變腸道微生物的代謝活性，導(dǎo)致腸道菌群的生態(tài)失調(diào)[23]。乙酸由宿主體內(nèi)多種厭氧菌產(chǎn)生，在細(xì)胞中，乙酸是碳水化合物和脂肪代謝途徑的核心，并且在這些過程中與輔酶A結(jié)合[24]，在結(jié)腸和體循環(huán)中濃度最高。丙酸也是通過細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的，一部分進(jìn)入體循環(huán)后可作為糖異生的產(chǎn)物，與機(jī)體血糖控制有關(guān)，并且其可作為奇數(shù)鏈脂肪酸代謝的中心產(chǎn)物，具有一定的潛在毒性，奇數(shù)鏈脂肪酸分解所必需的酶會(huì)導(dǎo)致丙酸等毒素在循環(huán)中積聚，導(dǎo)致嘔吐、脫水、酸中毒、低肌張力、癲癇發(fā)作和嗜睡[25]。丁酸大部分直接作用于腸道，與2型糖尿病的保護(hù)作用密切相關(guān)[26]，其可以通過降低LPS易位來減輕機(jī)體炎癥，同時(shí)可以激活小鼠結(jié)腸細(xì)胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ，抑制兼性厭氧致病菌的生長，促進(jìn)健康腸道菌群[27]。小鼠糞便總酸水平如圖7(A) 所示，造模組小鼠糞便中總酸含量明顯下降(P<0.05)，而二甲雙胍藥物組經(jīng)藥物治療后，總酸含量明顯回升，與空白組沒有明顯差異，這說明藥物組治療效果明顯，且乳酸菌組總酸含量較模型組有所上升，復(fù)合組總酸含量上升明顯，與模型組有顯著性差異(P<0.05)，這說明復(fù)合組治療效果顯著，且優(yōu)于乳酸菌組。如圖7(B～D) 所示為小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠三者含量明顯下降(P<0.05)，這與CAO等[11]的研究一致，糖尿病會(huì)導(dǎo)致短鏈脂肪酸含量下降，可能是因?yàn)樘悄虿?dǎo)致腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)，促進(jìn)致病菌生長，抑制有益菌生長，降低腸道內(nèi)的發(fā)酵反應(yīng)，減少短鏈脂肪酸的生成，而藥物組、乳酸菌組、復(fù)合組乙酸、丙酸和丁酸水平明顯回升，均展現(xiàn)出較好的治療效果。

A-總酸；B-乙酸；C-丙酸；D-丁酸；E-相關(guān)性分析圖7 不同組別小鼠總酸、乙酸、丙酸和丁酸含量及相關(guān)性分析Fig.7 Total acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid in different groups of mice and correlation analysis

短鏈脂肪酸是由某些腸道微生物通過復(fù)雜的多糖發(fā)酵產(chǎn)生，通過數(shù)據(jù)來解析短鏈脂肪酸生成與腸道微生物之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖7-E所示，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus和Ruminococcus與短鏈脂肪酸的生成呈正相關(guān)性，且與乙酸、丁酸和丙酸的生成呈正相關(guān)性，而Akkermansia和Bifidobacterium與丁酸的生成呈正相關(guān)性。GABRIELLA等[28]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌NCFM和動(dòng)物雙歧亞種能夠顯著增強(qiáng)人結(jié)腸模型中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，尤其是乙酸、丙酸和丁酸。Ruminococcus[29]是公認(rèn)的產(chǎn)丁酸的菌，丁酸的減少會(huì)促進(jìn)炎癥并破壞正常的腸道屏障功能，患有2型糖尿病的個(gè)體在其腸道中表現(xiàn)出產(chǎn)丁酸菌豐度的下降，Rikenellaceae_g_與Dorea是腸道內(nèi)的致病菌，與乙酸、丙酸和丁酸的生成呈明顯的負(fù)相關(guān)性，說明Rikenellaceae_g_與Dorea豐度的增加在一定程度上抑制了腸道微生物發(fā)酵生成短鏈脂肪酸。ZHANG等[30]研究發(fā)現(xiàn)，利用E.gardneri水提取物可以調(diào)節(jié)腸道微生物，模型組中腸道菌群發(fā)生明顯的Rikenellaceae_g_與Dorea豐度上升，出現(xiàn)乙酸和丙酸下降，干預(yù)治療后，菌群豐度下降，短鏈脂肪酸產(chǎn)量增多。短鏈脂肪酸與腸道微生物之間的相關(guān)性分析可以發(fā)現(xiàn)Lactobacillus、Ruminococcus等腸道有益菌可以促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，促進(jìn)腸道健康，而Rikenellaceae_g_與Dorea等腸道致病菌的滋生會(huì)破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，加劇機(jī)體炎癥水平。乳酸菌組和藥物組均起到改善腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)的癥狀。

3 結(jié)論

通過將具有緩解2型糖尿病能力的植物乳桿菌X1、鼠李糖乳桿菌CCFM0528與富鉻酵母進(jìn)行復(fù)配，應(yīng)用于高脂飼料和STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)藥物組發(fā)揮了緩解2型糖尿病的作用，而乳酸菌組與復(fù)合組能夠有效增加乙酸、丙酸和丁酸含量，改善腸道菌群的豐度，增加有益菌Bifidobacterium、Lactobacillus、Akkermansia和Ruminococcus豐度，減少致病菌Anaerostipes、Coprococcus、Dorea和Rikenellaceae-g_的豐度，在一定程度上緩解了2型糖尿病的腸道失調(diào)。其中復(fù)合組相比乳酸菌組的保護(hù)效果更顯著，更顯著增加Lactobacillus的豐度，降低Coprococcus和Rikenellaceae-g_的豐度，同時(shí)短鏈脂肪酸含量被顯著增加。綜上，復(fù)合組對(duì)2型糖尿病小鼠腸道菌群失調(diào)具有最顯著的改善作用。本研究的成果將為益生菌復(fù)配劑應(yīng)用于2型糖尿病的干預(yù)治療提供重要參考依據(jù)。