劉夢迪張連峰呂 丹*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

心肌肥厚通常是作為對血流動(dòng)力學(xué)壓力或心肌損傷的適應(yīng)性反應(yīng)而引發(fā)的[1-2],表現(xiàn)為心肌質(zhì)量增加,收縮力增加,對增強(qiáng)心臟功能、降低心室壁張力和耗氧量具有補(bǔ)償作用,有助于維持心輸出量,維持正常的血液循環(huán),是一種緩慢發(fā)展的有效代償功能。 在細(xì)胞學(xué)方面,心肌肥厚的特點(diǎn)是心肌細(xì)胞變大,肌節(jié)結(jié)構(gòu)分離,蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)以及胎兒基因重新表達(dá)。 在心肌肥厚的超聲心動(dòng)圖中可觀察到增厚的室間隔,縮小的左心室腔,變窄的左室流出道,且二尖瓣前葉收縮期前移,主動(dòng)脈瓣收縮中期呈現(xiàn)出部位性關(guān)閉等。 雖然心肌肥厚最初可能是代償性和適應(yīng)性的,在心血管疾病的早期階段可以提供某些益處,但長期病理學(xué)心肌肥厚將改變心臟基因的表達(dá),細(xì)胞間肌纖維和血管周圍纖維化及功能障礙,從而導(dǎo)致失代償,心力衰竭和猝死的發(fā)生率增加。 目前的研究表明,腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑(renin-angiotensin system inhibitor,RASI)、β 受體阻滯劑(beta blocker,BB)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、他汀類藥物等對心肌肥厚有一定的治療效果。 RASI 和BB 聯(lián)合拮抗交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng),對心室的重構(gòu)、新功能的改善以及遠(yuǎn)期預(yù)后等方面有益[3-7]。 本文對心肌肥厚動(dòng)物模型及代償失代償分子機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行了歸納總結(jié)。

1 心肌肥厚動(dòng)物模型及制備方法

心肌肥厚動(dòng)物模型已經(jīng)在小鼠、大鼠、犬、羊、豬等物種中建立,小鼠及大鼠的優(yōu)點(diǎn)是基因背景信息齊全,商品化試劑豐富,同時(shí)經(jīng)濟(jì)且易飼養(yǎng)。 大動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)是操作容易,重復(fù)性好,對動(dòng)物造成的損傷較小,存活率高,并且更符合人體解剖和血流動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn),尤其是豬。

1.1 大鼠心肌肥厚模型

目前大鼠模型在心臟損傷相關(guān)研究中仍占主導(dǎo)地位,它們較大的尺寸極大地促進(jìn)了手術(shù)操作和術(shù)后研究,其心肌肥厚模型的建立采取物理法、化學(xué)法和生物法。

1.1.1 物理法

物理法包括壓力超負(fù)荷法、容量負(fù)荷法、心肌梗死和運(yùn)動(dòng)致心肌肥厚[3]。

壓力超負(fù)荷法主要包括:(1)主動(dòng)脈縮窄法(transverse aortic constriction,TAC):在大鼠無名動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈之間結(jié)扎主動(dòng)脈弓,經(jīng)過4 周形成明顯的左心室心肌肥厚；(2) 腹主動(dòng)脈縮窄法(abdominal aortic constriction,AAC):在大鼠的腹腔動(dòng)脈和腸系膜前動(dòng)脈之間進(jìn)行結(jié)扎,得到重建后的直徑為0.55 mm。 在AAC 術(shù)后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查,同時(shí)結(jié)合組織學(xué)和血漿腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平綜合評判,術(shù)后第4 周誘導(dǎo)左心室心肌肥厚。 (3)腎型高血壓法[8-10]:把左腎動(dòng)脈用內(nèi)徑為0.2 mm 的銀夾夾住,造成腎缺血,使腎內(nèi)產(chǎn)生腎素,增加血內(nèi)的血管緊張素Ⅱ含量,致使高血壓形成,長期刺激而產(chǎn)生心肌肥厚。 術(shù)后避免感染需給予青霉素,4 周后在清醒狀態(tài)無創(chuàng)收縮壓≥160 mmHg 者為造模成功。 該方法的優(yōu)點(diǎn)在于同人類的病理模型相似,由于高血壓比較穩(wěn)定,可逐漸形成心肌肥厚,因此該模型也常被用來研究心肌肥厚。

容量負(fù)荷法包括:(1)動(dòng)靜脈造瘺法:腹部正中進(jìn)行切口,在其左腎動(dòng)脈下面分離出腹主動(dòng)脈和下腔靜脈,血管夾夾斷血流。 9 號靜脈注射針依次穿過下腔靜脈壁和動(dòng)靜脈聯(lián)合壁,鮮紅色動(dòng)脈血流出后將針頭退出,然后進(jìn)行縫合。 造瘺成功的標(biāo)志為松開血管夾后,見下腔靜脈紅色血流,這種方法4～5周可形成心肌肥厚；(2)DOCA 鹽敏感性高血壓法[11]:切除大鼠的左腎,在術(shù)后1 周皮下植入含去氧皮質(zhì)醇(deoxycortisol,DOCA) 的微泵或注射DOCA,按照50 mg/kg 連續(xù)每天給藥,持續(xù)9 周,術(shù)后8 周便可形成心肌肥厚。

心肌梗死致心肌肥厚采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎、堵塞或促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血栓形成等方法[12-13],有研究顯示在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支一周后可見心肌肥厚。

運(yùn)動(dòng)致心肌肥厚[13-14]包括:(1)跑輪訓(xùn)練致心肌肥厚:在有一定阻力的跑輪上無外界干擾進(jìn)行自主訓(xùn)練,跑步距離在2～4 周達(dá)到每天10 ～15 km,此時(shí)距離最長,之后為每天小于4 km,3 ～4 周可觀察到心肌肥厚；(2)游泳訓(xùn)練致心肌肥厚:對大鼠進(jìn)行每日2 次,每次1 h,每周5 d,為期8 周的游泳訓(xùn)練,可見發(fā)生顯著的心肌肥厚。

1.1.2 化學(xué)法

化學(xué)法是利用化學(xué)試劑或藥物對動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生作用而誘發(fā)動(dòng)物疾病[15-17]。 化學(xué)法誘發(fā)心肌肥厚主要是藥物誘導(dǎo)法,該方法需要的時(shí)間短、操作簡便且心肌肥厚可很快形成、出現(xiàn)明顯的心肌病變。 具體操作過程即給受試動(dòng)物注射或在皮下植入滲透泵等,使其在某一種藥物的持續(xù)刺激下形成心肌肥厚。 主要用的藥物有去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、去氧腎上腺素(phenylephrine,PE)、異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)、 甲 狀 腺 素、 血 管 緊 張 素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)等。

1.1.3 生物法

生物法目前有自發(fā)性高血壓大鼠模型[10]。 自發(fā)性高血壓大鼠在出生之后,隨著時(shí)間變化,血壓不斷升高,心肌質(zhì)量在4 周時(shí)開始增加,血壓在3～4個(gè)月時(shí)穩(wěn)定升高,心肌肥厚加重。

1.2 小鼠心肌肥厚模型

上面闡述的大鼠制備方法,在小鼠上亦可獲得心肌肥厚,同時(shí),小鼠是目前基因修飾種類最為豐富的物種,在研究基因功能及相關(guān)發(fā)病機(jī)制方面應(yīng)用最為廣泛,通過基因修飾可以獲得遺傳性心肌肥厚模型。 此外,在感興趣基因的基礎(chǔ)修飾小鼠上給予心肌肥厚刺激,是小鼠心肌肥厚模型未來的主要研究方向。

基因修飾獲得心肌肥厚包括:1)肌球蛋白突變模型:2 條重鏈(MHC)和2 條輕鏈(MLC)一同構(gòu)成肌球蛋白,MHC 又有 α 和 β 兩種亞型。 小鼠 α-MHC 基因第403 密碼子錯(cuò)義突變會(huì)致使其左心房心肌肥厚；2)肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC)突變模型:小鼠的心肌肥厚可由MYBPC 的缺失、插入或剪接位點(diǎn)的突變等致使；3)肌鈣蛋白突變[18]:小鼠TnT 突變,該突變導(dǎo)致TnT 外顯子缺失小鼠表現(xiàn)出較小的左心室,嚴(yán)重的舒張期和較輕的收縮功能障礙。

1.3 大型動(dòng)物心肌肥厚模型

嚙齒類動(dòng)物與人類的心臟在結(jié)構(gòu)、心率、耗氧量、收縮力、蛋白質(zhì)表達(dá)等方面都存在差異,因此,大型動(dòng)物心肌肥厚及代償失代償模型的建立具有重要研究價(jià)值。

大型動(dòng)物除了上面闡述的DOCA 鹽敏感性高血壓法、化學(xué)法外,其特有的心肌肥厚模型建立方法有:1)二尖瓣返流(mitral regurgitation,MR)致心肌肥厚:常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為犬或羊。 該方法采用胸內(nèi)或開胸手術(shù)斷裂動(dòng)物瓣膜上的腱索來破壞二尖瓣,前者借助超聲定位,用心肌活檢鉗將二尖瓣前葉緣上一條腱索夾斷；后者需在胸骨正中切口,將心包切除,金屬器械插進(jìn)左心室心尖或切開心房來將腱索破壞,從而造成二尖瓣關(guān)閉不全,致使心肌肥厚；2)主動(dòng)脈束帶法[19]:常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為豬。該方法是進(jìn)行手術(shù)干預(yù),通過結(jié)扎或夾子(主動(dòng)脈束帶)部分阻塞升主動(dòng)脈或降主動(dòng)脈,然后突然增加閉塞前壓力,通過束帶逐漸形成主動(dòng)脈縮窄以及肺動(dòng)脈或腎動(dòng)脈狹窄,從而引起左心室肥厚。

2 心肌肥厚分子機(jī)制研究進(jìn)展

心肌肥厚通常是作為對血流動(dòng)力學(xué)壓力或心肌損傷的適應(yīng)性反應(yīng)而引發(fā)的,即心臟為適應(yīng)各類刺激而發(fā)生的心肌質(zhì)量增加,體積增大。 在初始的代償階段,心室容積輕微增大,肥大的心肌細(xì)胞收縮和舒張的時(shí)間變長,速度變慢,但仍可保持良好的肌纖維縮短和心室排空能力。 心肌肥厚是很多心臟疾病發(fā)展的一個(gè)重要階段,但它的形成機(jī)制仍不完全清楚,目前有關(guān)的研究都集中在一些通路上。

2.1 有絲分裂蛋白激酶(MAPKs)信號通路

MAPK 信號通路包括以下分支:1)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERKs):ERK 分支的信號通常在細(xì)胞膜上與Ras 激活協(xié)同啟動(dòng)。 Ras 與Raf 偶聯(lián),之后偶聯(lián) MAPK 激酶MEK1 和MEK2,MEK1/2 作為雙重特異性激酶起作用,可直接磷酸化ERK1 和ERK2 激酶中的TEY基序；2)c-Jun N 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNKs):MAPK 激酶激酶的激活,如MEKK1,促進(jìn)雙重特異性激酶MKK4 和MKK7 的激活,進(jìn)而直接磷酸化JNK 蛋白中的 TPY 基序；3)p38 激酶[20]:p38激酶中的TGY 基序可以通過激酶之間的偶聯(lián)被磷酸化而發(fā)揮作用。 在心肌細(xì)胞中,上述三個(gè)MAPK分支中的每一個(gè)都由G 蛋白偶聯(lián)受體(G proteincoupled receptors,GPCRs)通過神經(jīng)內(nèi)分泌因子如血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1 和兒茶酚胺來調(diào)節(jié),此類激活特征表明MAPK 信號介導(dǎo)或調(diào)節(jié)心臟肥大反應(yīng)。

2.2 Ca2+介導(dǎo)的信號通路

在細(xì)胞內(nèi),增多的Ca2+可致使心肌肥厚,這可以作為最基本的信號。 其主要機(jī)制有:(1)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)信號通路[21-23]:CaN 直接與細(xì)胞質(zhì)中活化T 細(xì)胞(nuclear factor of activated T cells,NFAT)轉(zhuǎn)錄因子的核因子結(jié)合并使其去磷酸化,從而使它們易位至細(xì)胞核中,介導(dǎo)肥大基因的表達(dá)；(2)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶信號通路:鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II 受Ca2+鈣調(diào)蛋白復(fù)合物和ROS 的調(diào)節(jié),交換蛋白被cAMP 激活,直接誘導(dǎo)心臟肥大。

2.3 蛋白激酶信號通路

蛋白激酶信號通路有[24-26]:1)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信號通路:Akt1 短期激活通過協(xié)調(diào)上調(diào)VEGF 的表達(dá)誘導(dǎo)生理性肥大,而Akt1 長期激活促進(jìn)病理性肥大；2)蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)及其介導(dǎo)的信號通路:PKC 在發(fā)揮作用時(shí),一方面可以直接移入細(xì)胞核調(diào)節(jié)核基因的表達(dá),另一方面可以在胞漿內(nèi)通過活化 Raf-1 與MAPK 信號通路偶聯(lián)。 有研究表明,α-腎上腺素能受體通過Gq-磷脂酶C 途徑激活PKC,這是對心臟肥大的有效刺激。

2.4 Janus 激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號通路

心肌表達(dá)多種IL-6 家族細(xì)胞因子[26-27]。 JAK/STAT 通路可以在IL-6 細(xì)胞因子與糖蛋白130 結(jié)合之后被激活,進(jìn)而參與細(xì)胞生物過程。 研究證實(shí),激活的JAK-STAT 通路可以致使心肌肥厚,并與心肌梗死、擴(kuò)張性心肌病等相關(guān)。

2.5 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路

AMPK 是細(xì)胞中的節(jié)點(diǎn)能量傳感器,可以隨著營養(yǎng)利用而協(xié)調(diào)代謝輸出的增加。 AMPK 是一種異源三聚體蛋白激酶,由催化性α 亞基、連接α 和γ的β 亞基和結(jié)合糖原組成,γ 亞基以相互排斥的方式結(jié)合 AMP、ADP 或 ATP。 AMPK 通過構(gòu)象變化導(dǎo)致其活化[28]。 能量水平下降導(dǎo)致 AMP 激活A(yù)MPK,通過刺激脂肪酸氧化,葡萄糖攝取和糖酵解及減少依賴于ATP 的過程來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。 因此,AMPK 對心臟動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要,大多數(shù)研究表明,長期抑制AMPK 會(huì)加劇病理性肥大,導(dǎo)致心力衰竭,而間歇性AMPK 激活可能具有心臟保護(hù)作用。

2.6 MicroRNAs(miRNAs)信號通路

MicroRNA(miRNA)的功能是使特定的mRNA轉(zhuǎn)錄功能沉默[29]。 單個(gè)miRNA 可能具有數(shù)十至數(shù)百個(gè)靶基因,并且有越來越多的證據(jù)表明miRNA 在心臟發(fā)育、肥厚和衰竭中起作用。

3 心肌肥厚失代償分子機(jī)制研究進(jìn)展

流行病學(xué)的研究表明,心臟正常的心肌肥大隨著時(shí)間的推移會(huì)降低心臟的功能,導(dǎo)致組織學(xué)纖維化、Ca2+處理蛋白失調(diào)、線粒體功能異常、心肌細(xì)胞損傷、舒張功能障礙和縱向收縮功能均惡化,發(fā)展為“心肌肥厚失代償”,并在臨床上會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。 心肌肥厚失代償?shù)姆肿訖C(jī)制研究主要集中在經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞的生長與凋亡以及心肌細(xì)胞的鈣代謝等方面。

3.1 經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路

3.1.1 血管緊張素Ⅱ系統(tǒng)及其信號通路

受體1(AT1)和受體2(AT2)是 Ang Ⅱ的受體[30-31],一些通路可在AngⅡ與AT1 結(jié)合后活化,而細(xì)胞生長的抑制及細(xì)胞凋亡均與AT2 有關(guān)。

3.1.2 G 蛋白和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)

研究表明,Gq 通過參與AngⅡ等誘導(dǎo)的信號傳遞來阻止Akt 磷酸化,則致使心肌細(xì)胞凋亡增強(qiáng),造成心臟的功能失調(diào)。 在β 腎上腺能受體激活后,腺苷酸環(huán)化酶被Gsα 亞單位激活產(chǎn)生cAMP,可以活化蛋白激酶A(protein kinases A,PKA)。 PKA 可以磷酸化多種與心肌功能有關(guān)的蛋白質(zhì)[32-33]。

3.1.3 生長因子及其信號傳導(dǎo)通路

多數(shù)生長因子受體是跨膜受體酪氨酸激酶,經(jīng)過 Ras、Raf、MEK、ERK 途徑活化轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)核內(nèi)基因的表達(dá)。 生長因子 FGFs、IGFs、PDGFs、TGFs[34],均會(huì)使得心肌細(xì)胞肥大。

3.2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要作用[35]。 有研究顯示,細(xì)胞凋亡致使的心肌細(xì)胞丟失,會(huì)引發(fā)心功能失調(diào),發(fā)展下去致使心衰,這說明細(xì)胞凋亡在心肌肥厚代償向失代償發(fā)展的過程之中起作用。

3.3 心肌細(xì)胞的鈣代謝

鈣代謝與心肌細(xì)胞舒縮聯(lián)系緊密[36]。 心肌鈣的鈣釋放是鈣離子通過細(xì)胞表面的L-型鈣離子通道(LCC) 內(nèi)流,激活肌質(zhì)網(wǎng)上的雷諾定受體(ryanodine receptor,RyR),促進(jìn)肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子流入胞質(zhì),從而引起胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時(shí)增加,其控制著心肌收縮的力量,研究表明在心臟肥大及失代償進(jìn)程中心肌鈣釋放失調(diào)發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié)語

多年來,國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了很多種心肌肥厚動(dòng)物模型的建立方法,即壓力超負(fù)荷法、容量負(fù)荷法、藥物誘導(dǎo)法、基因修飾法等。 心肌肥厚動(dòng)物模型的成功率、和人的相似程度都在逐漸提高,這對心肌肥厚的研究具有推動(dòng)作用。

心肌肥厚可致使血壓降低、心肌細(xì)胞肥大和凋亡,心室順應(yīng)性下降以及射血功能受損,從而使得心臟功能惡化。 總而言之,心肌肥厚已經(jīng)是心血管疾病領(lǐng)域內(nèi)越來越重要的因素,所以探索其機(jī)制尤為重要。 很多研究證明其過程與一些信號通路有關(guān),這些信號通路交織在一起,信號通路效應(yīng)因子之間相互作用,形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。 雖然在分子機(jī)制方面已經(jīng)取得很大進(jìn)展,但許多問題仍未完全清楚,需要進(jìn)一步探究。