鐘 健朱佳瑞何欣宇馬婧怡李睿祺張金波

(佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

由于納米材料具有優(yōu)良的理化性質(zhì),越來越廣泛的被應(yīng)用到催化、材料、軍事、機(jī)械、電子、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。 納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域表現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),在構(gòu)建藥物載體、藥物的控釋緩釋等方面擁有巨大的應(yīng)用前景。 隨著納米材料日益廣泛的應(yīng)用,人們接觸到納米材料的機(jī)會(huì)越來越多,對(duì)納米材料的生物安全性研究也越來越迫切。 目前,已有不少納米材料的毒理學(xué)研究[1-3],但許多納米材料的毒性效應(yīng)或體內(nèi)毒性機(jī)制仍不明確,納米材料的生物安全性需更進(jìn)一步的研究和探討。

目前,已有諸多研究表明斑馬魚是納米毒理學(xué)較為理想的模式生物。 斑馬魚作為一種脊椎動(dòng)物,與人類基因的相似度高達(dá)87%[4],其生理或藥理反應(yīng)與人類具有很高的相似性,所以其在毒理學(xué)的研究當(dāng)中具有很強(qiáng)的說服力。 相比大鼠、小鼠,斑馬魚具有體外受精、胚胎在體外發(fā)育且透明易于觀察的優(yōu)勢(shì),另外,其體型小易于飼養(yǎng),繁殖率高(成熟雌魚每次可產(chǎn)卵100～300 枚)為統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算提供了充足的樣本數(shù)量；發(fā)育速度快且不同的發(fā)育階段特征明顯,可在胚胎發(fā)育的不同階段做不同的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)且試驗(yàn)周期短。 所以斑馬魚是一種理想的毒理學(xué)模式生物,且已經(jīng)在胚胎發(fā)育毒理學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用[5-6]。 如今斑馬魚模型也愈來愈多的被應(yīng)用到納米毒理學(xué)的研究當(dāng)中。

1 納米材料對(duì)斑馬魚的毒性作用

由于斑馬魚的基因與人類基因相似度極高,將斑馬魚作為模式生物進(jìn)行納米毒理學(xué)研究具有很高的準(zhǔn)確性和可信度。 在實(shí)驗(yàn)中,納米材料對(duì)斑馬魚所造成的各方面毒性作用也更貼近人類,實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。 研究表明,納米材料可對(duì)斑馬魚造成的毒性作用包括消化系統(tǒng)毒性、生殖系統(tǒng)毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、胚胎毒性等。

1.1 消化系統(tǒng)毒性

研究表明,引起消化系統(tǒng)的毒性損傷是納米材料最普遍的毒性效應(yīng)之一,納米材料進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)后,富集于肝和腸道最為多見,因此對(duì)肝和腸道的損傷也更為顯著。

1.1.1 腸道損傷

L?vmo 等[7]研究表明,納米顆粒作用于成年斑馬魚,經(jīng)口腔攝入并進(jìn)入腸道,經(jīng)切片定位成像顯示,納米顆粒在腸道內(nèi)被迅速吸收,使腸道內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng),并轉(zhuǎn)移到肝和脾。 Sung 等[8]分別將30 nm 和80 nm 的納米金和銀(nano-Au/nano-Ag)作用于成年斑馬魚,顯示大部分納米粒子均在肝、腸、鰓組織中被攝取,其中大粒徑(80 nm)納米粒子在肝和腸道組織中積累分布,小粒徑(30 nm)納米粒子在鰓中被過濾而聚集。 而Osborne 等[9]關(guān)于納米粒子粒徑和分布關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)與Sung 正好相反,Osborne 等[9]將成年斑馬魚分別暴露于兩種不同粒徑(20 nm、110 nm)檸檬酸鈉包被的nano-Ag,研究顯示,在20 nm 粒徑組的斑馬魚腸道中基底外側(cè)膜可觀察到明顯的納米粒子沉積,在110 nm 粒徑組則未觀察到明顯沉積。 Osborne 等[9]認(rèn)為 nano-Ag 在腸道基底外側(cè)膜沉積的機(jī)制與腸道基底外側(cè)膜上的Na+/K+離子通道的破壞和ATP 酶活性降低有關(guān)。 說明粒徑大小和在器官分布的關(guān)系并非絕對(duì),其分布的影響還與其他因素相關(guān)。 Chen 等[10]將濃度為100 μg/L 的納米氧化鈦(nano-TiO2)作用于成年斑馬魚,研究顯示,nano-TiO2可影響腸道神經(jīng)調(diào)節(jié)、增加腸上皮屏障滲透性、引起炎癥和氧化應(yīng)激等。 另外nano-TiO2的長(zhǎng)期暴露會(huì)引起斑馬魚腸道內(nèi)菌群失調(diào),造成損傷。 Kang 等[11]將濃度為(0.156、0.313、0.625、1.25、2.5 mg/mL)的碳量子點(diǎn)(C-QDs)溶液通過浸泡法作用于斑馬魚胚胎,實(shí)驗(yàn)表明,C-QDs 主要聚集在斑馬魚胚胎的頭部、腸道和尾巴,其中腸道的聚集最為顯著。 經(jīng)染毒的斑馬魚胚胎在純水中靜置24 h 后,低濃度組(0.156、0.313、0.625 mg/mL)的C-QDs 已完全清除出體外,僅在高濃度組(1.25、2.5 mg/mL)中有少量殘留并伴有腸道輕微損傷,48 h 后,所有實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎腸道內(nèi)的C-QDs 均已消除。 說明在腸道內(nèi)富集的C-QDs 可完全經(jīng)代謝清除,但高濃度處理時(shí)仍會(huì)對(duì)腸道造成輕微損傷。 雖然目前關(guān)于納米粒子在腸道內(nèi)分布情況和影響其分布或毒性損傷的機(jī)制尚不明確,但已有充分證據(jù)說明腸道是納米粒子的毒性靶器官之一。

1.1.2 肝損傷

肝是機(jī)體內(nèi)重要的解毒器官,也是納米粒子最易發(fā)生富集的部位之一。 在眾多研究中,納米粒子在肝當(dāng)中聚集可破壞肝結(jié)構(gòu)、影響肝功能。 Ren等[12]將 0.9 mg/L 的 nano-TiO2連續(xù) 21 d 作用于成年斑馬魚,發(fā)現(xiàn)nano-TiO2在斑馬魚體內(nèi)呈富集狀態(tài),主要集中分布于大腦、性腺和肝,其中肝的含量最高,其次是大腦和性腺。 段延芳[13]將6 種濃度(0、25、50、200、400 μg/mL)的三種上轉(zhuǎn)換納米材料(鉺離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+,Er3+)、銩離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+, Tm3+)、鉺離子與鐿離子相摻的四氟釓鈉(NaGdF4:Yb3+, Er3+)作用于受精后 24 h(hours post-fertilization,hpf)的斑馬魚胚胎,結(jié)果顯示,以上三種納米材料均易富集在心臟和肝,其中對(duì)于肝的毒性損傷最為顯著,可引起肝發(fā)育畸形；引起肝細(xì)胞水腫、壞死。 染毒濃度越大,引起的肝損傷越嚴(yán)重。 Souza 等[14]將成年斑馬魚分別暴露于三種濃度(2、10、20 mg/L)的氧化石墨烯(GO)中,研究顯示,GO 可使肝細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、核固縮、形成液泡、細(xì)胞破裂和壞死,作用濃度越高,肝細(xì)胞損傷越顯著。Gao 等[15]發(fā)現(xiàn)暴露于納米二氧化錳(nano-MnO2)的成年斑馬魚肝細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄功能障礙,α 淀粉酶、羧酸酯水解酶、羧肽酶等代謝酶類合成受到抑制,使肝功能受損。 劉林等[16]將成年斑馬魚暴露于不同濃度(0、0.05、0.1、5、10、25、50 mg/L)的納米氧化鋅(nano-ZnO)中分別處理4 h、24 h、96 h,結(jié)果顯示肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫、氣球樣變,核固縮；肝巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加；丙二醛(MDA)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性增強(qiáng),但過氧化氫酶(CAT)活性下降；基因Bax/Bcl-2 比值、p53 表達(dá)水平上調(diào)。 說明nano-ZnO 能引起肝細(xì)胞變性壞死、引起氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使斑馬魚肝嚴(yán)重?fù)p傷。 以上研究表明,納米材料可以在肝當(dāng)中大量聚集,并能引起組織和功能損傷,肝中的各種酶活性發(fā)生變化和基因表達(dá)的改變是引起肝損傷的主要原因。

1.2 生殖系統(tǒng)毒性

眾多研究指出,性腺也是納米材料易于富集的臟器,納米材料可對(duì)斑馬魚的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。 Fang 等[17]將濃度為 100 μg/L 的 nano-TiO2作用于成年斑馬魚(雌雄各半),研究顯示,nano-TiO2被吸收后可轉(zhuǎn)移聚集到性腺,使斑馬魚血漿雌二醇(E2)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)濃度降低,卵黃原蛋白(VTG)濃度顯著升高。雖然在nano-TiO2作用下,斑馬魚的卵巢和睪丸并未出現(xiàn)顯著的形態(tài)改變,但各種激素水平不同程度改變導(dǎo)致了內(nèi)分泌的失調(diào)和生殖障礙。 Kotil 等[18]將成年斑馬魚暴露于三種濃度(1、2、4 mg/L)的nano-TiO2,取斑馬魚睪丸組織檢測(cè),結(jié)果表明,nano-TiO2可使斑馬魚睪丸間質(zhì)細(xì)胞和精原細(xì)胞有絲分裂紊亂,伴有細(xì)胞變性,在睪丸間質(zhì)細(xì)胞可見自噬泡大量聚集。 隨著nano-TiO2處理濃度增加,細(xì)胞和組織損傷也越嚴(yán)重,引起間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞、精原細(xì)胞的細(xì)胞自噬、壞死,造成生殖毒性。 以上研究說明納米粒子可以通過改變斑馬魚各激素水平或直接對(duì)性腺造成組織損傷,從而對(duì)生殖系統(tǒng)造成毒性影響。

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)毒性

研究表明,腦是納米粒子易于聚集的器官之一,納米材料可對(duì)斑馬魚腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷。 Sheng 等[19]將成年斑馬魚暴露于5 種濃度(5、10、20、40 μg/L)的 nano-TiO245 d,研究顯示nano-TiO2可使斑馬魚去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺的水平顯著降低,NO 水平顯著升高,膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖,神經(jīng)元凋亡,同時(shí)nano-TiO2能顯著激活原癌基因 C-fos、C-jun、BDNF 基因表達(dá),抑制p38、NGF、CREB、NR1、NR2ab、GluR2 基因表達(dá)。 說明nano-TiO2可對(duì)斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷。Wu 等[20]將魚齡4 個(gè)月的斑馬魚暴露于不同濃度(0、0.5、4、32 μg/L)的 nano-TiO2中,結(jié)果顯示,出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成和腦室增大等明顯的腦損傷。nano-TiO2引起的腦損傷機(jī)制主要引起了腦內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生,腦內(nèi) MAD、SOD、GSH 活性降低,使腦組織傾向與發(fā)生氧化應(yīng)激,造成了斑馬魚大腦的嚴(yán)重?fù)p傷,并出現(xiàn)游泳和社會(huì)行為異常。 以上研究說明腦是納米粒子的毒性靶器官之一,可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷,并引起功能障礙。

1.4 胚胎毒性

研究表明,納米材料可引起斑馬魚胚胎顯著的毒性損傷,影響斑馬魚胚胎正常發(fā)育、引起不同程度的畸形。 Kang 等[11]分別將(0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL)的C-QDs 溶液作用于斑馬魚胚胎,結(jié)果表明,(0.5、1.0、1.5 mg/mL)組的胚胎存活率均高于80%,略低于對(duì)照組存活率95%,而2.5 mg/mL 組的存活率僅為55%。 說明C-QDs 在低濃度作用下,毒性較小。 段延芳[13]將 6 種濃度(0、25、50、200、400 μg/mL)的三種上轉(zhuǎn)換納米材料鉺離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+, Er3+)、銩離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+, Tm3+)、鉺離子與鐿離子相摻的四氟釓鈉(NaGdF4:Yb3+, Er3+)分別作用于24 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果顯示,隨作用劑量的增大,斑馬魚胚胎的畸形率隨之增加。 其引起的畸形主要有:魚鰾發(fā)育緩慢或異常、脊柱彎曲、肝畸形、心包囊水腫、卵黃囊異常。 其中以魚鰾發(fā)育緩慢及肝畸形最為常見。 Ahmad 等[21]將平均粒徑為40 nm 的CoFe2O4納米粒子(nano-CoFe2O4)作用于斑馬魚胚胎(96 hpf),觀察發(fā)現(xiàn),能引起斑馬魚胚胎嚴(yán)重心臟水腫、代謝下調(diào)、孵化延遲、尾巴/脊髓彎曲,另外nano- CoFe2O4的聚集和離子溶解對(duì)胚胎細(xì)胞膜造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷和氧化應(yīng)激,其中頭部、心臟、尾部細(xì)胞最為顯著。 李翔[22]將斑馬魚受精卵暴露于兩種不同粒徑(15 nm、50 nm)濃度范圍在(50-1000 μg/mL)的納米二氧化硅(nano-SiO2),結(jié)果顯示經(jīng)兩種粒徑處理后受精卵的孵化率都出現(xiàn)降低、死亡率和畸形率均顯著增加,且隨納米粒子處理濃度的增高,畸形率升高的越顯著。 其中在100 μg/mL 濃度處理時(shí),受精卵畸形率高達(dá)60%,并出現(xiàn)輕微心包水腫,當(dāng)處理濃度大于300 μg/mL時(shí),受精卵畸形率大于95%。 隨處理濃度的增加,畸形程度越嚴(yán)重,其中畸形的種類包括:心包水腫(PE),卵黃膜畸形(YM),脊柱彎曲(BS),小頭(SH),小眼(SE),尾部畸形(TM),發(fā)育不良(SG)。Choi 等[23]將96 hpf 的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的(0.01、0.1、1、10 mg/L)nano-ZnO 中,研究發(fā)現(xiàn)心包水腫和卵黃囊水腫是nano-ZnO 所導(dǎo)致的主要畸形,使用微陣列的基因表達(dá)譜顯示在暴露于nano-ZnO 后,689 個(gè)基因中有 498 個(gè)上調(diào),191 個(gè)下調(diào)。所以其至畸原因可能與斑馬魚基因上調(diào)、下調(diào)密切相關(guān)。 Ong 等[24]將斑馬魚受精卵暴露于多種納米粒子(納米硅(nano-Si)、納米銀(nano-Ag)、納米氧化鋅(nano-ZnO)、納米硒化鎘(nano-CdSe)、單壁碳納米管(SWCNT)),研究顯示暴露于10 mg/L nano-Ag 和 nano-CdSe 可延遲斑馬魚孵化,100 mg/L nano-CdSe 以及 10 mg/L 和 100 mg/L nano-ZnO 可完全抑制孵化,使胚胎在絨毛膜內(nèi)死亡。 經(jīng)研究證實(shí),抑制斑馬魚孵化的是納米粒子本身,而非其金屬溶解成分。 以上研究表明,納米粒子可對(duì)斑馬魚胚胎造成較顯著的毒性作用。 另外,斑馬魚胚胎對(duì)于納米粒子的毒性十分敏感、效應(yīng)顯著,是納米毒理學(xué)研究的理想模型。

2 納米材料對(duì)斑馬魚造成毒性的作用機(jī)制

為使納米材料在日益廣泛的研究和應(yīng)用中具有安全性,勢(shì)必要清楚其對(duì)機(jī)體的毒性機(jī)制。 但納米粒子對(duì)機(jī)體的毒性機(jī)制研究尚不充分,目前,眾多以斑馬魚為模型研究納米粒子毒性機(jī)制的研究表明,發(fā)生氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)改變、細(xì)胞周期改變是納米粒子引起斑馬魚毒性的主要機(jī)制。

2.1 氧化應(yīng)激

已有研究表明,納米粒子引起機(jī)體細(xì)胞最主要、最顯著的毒性影響即引起氧化應(yīng)激。 Xiong等[25]分別將50 mg/L 納米二氧化鈦(nano-TiO2)和5 mg/L 納米氧化鋅(nano-ZnO)作用于成年斑馬魚,結(jié)果表明nano-TiO2和nano-ZnO 可使斑馬魚鰓、消化道、肝的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)發(fā)生不同程度的改變,使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激。 Shih等[26]將金紅型 nano-TiO2染毒斑馬魚成魚,表明nano-TiO2使斑馬魚鰓和肝組織的SOD 活性顯著降低,發(fā)生氧化應(yīng)激,造成鰓、肝的氧化損傷。 高悅[27]將斑馬魚尾鰭傷口暴露于平均粒徑為10 nm 的經(jīng)檸檬酸鈉包被的納米銀顆粒(nano-Ag),發(fā)現(xiàn)活性氧(reactive oxygen species,ROS)在暴露的尾鰭傷口細(xì)胞大量產(chǎn)生,引起氧化應(yīng)激,中性粒細(xì)胞超過正常水平約50%,使再生尾鰭增殖細(xì)胞顯著減少,凋亡細(xì)胞增多,造成毒性作用。 Wu 等[20]將魚齡4 個(gè)月的斑馬魚暴露于不同濃度(0、0.5、4、32 μg/L)的納米TiO2中,發(fā)現(xiàn)能使斑馬魚腦內(nèi)的ROS 大量生成,同時(shí)腦內(nèi)MAD、SOD、GSH 等含量均出現(xiàn)變化,證實(shí)腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激,造成斑馬魚腦組織損傷。Zhu 等[28]將受精后2 h(hours post-fertilization, hpf)的斑馬魚胚胎分別暴露于粒徑為15 和30 nm 的納米二氧化硅(nano-SiO2),用三種濃度(25、50、100 mg/L)分別處理5 d,結(jié)果表明,粒徑越小、濃度越大的nano-SiO2對(duì)斑馬魚胚胎體內(nèi)的ROS 含量影響越大,引起斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激也越嚴(yán)重。 以上研究表明,不同的納米粒子均可以造成斑馬魚發(fā)生氧化應(yīng)激,引起毒性作用。

2.2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種為維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)而主動(dòng)發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡,許多研究表明納米粒子可引起斑馬魚細(xì)胞凋亡,造成機(jī)體的毒性損傷。 Du 等[29]將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度(0、12.5、25、50 mg/L)的nano-ZnO 溶液中,隨著處理濃度的升高,斑馬魚胚胎體內(nèi)的 SOD、 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)和Caspase-9 酶的活性顯著升高,CAT 酶活性被抑制,同時(shí),細(xì)胞凋亡相關(guān)基因:Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)、腫瘤抑制基因P53、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達(dá)改變,斑馬魚胚胎氧化損傷并引起細(xì)胞凋亡。 馬爽[30]將nano-SiO2作用于斑馬魚胚胎,研究顯示SiO2可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BIP)、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α(e-IF2α)表達(dá),引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BAX、BID、Bcl-2、Mcl-1b表達(dá)量改變,引起細(xì)胞凋亡,造成斑馬魚胚胎的毒性損傷。Zhao 等[31]使用 5 種濃度(10、30、60、90、120 mg/L)的nano-ZnO 處理斑馬魚胚胎,顯示nano-ZnO 可使促凋亡基因(Bax、Puma、Apaf-1)上調(diào),而抗凋亡基因Bcl-2 下調(diào),且凋亡細(xì)胞的百分率呈劑量依賴性增加(0.41% ～4.21%)。 另外,斑馬魚胚胎細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)發(fā)生變化,以及 Caspases-9 和 Caspases-3 被激活,說明nano-ZnO 可激活線粒體通路引起細(xì)胞凋亡,引起斑馬魚胚胎細(xì)胞毒性作用。 已有研究表明,線粒體是納米材料生物毒性的主要作用靶點(diǎn),所以線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路是納米粒子引起細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[32]。 Gao 等[33]將斑馬魚胚胎暴露于粒徑為50 nm 的nano-Ag 當(dāng)中,顯示可干擾氧在胚胎血管細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散,造成細(xì)胞缺氧,同時(shí)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并造成胚胎血管上皮細(xì)胞凋亡,影響斑馬魚胚胎血管的發(fā)育。 Zhou 等[34]使用聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米膠束(PEG-b-PCL)作用于斑馬魚胚胎,結(jié)果顯示,能引起p53 基因上調(diào),血管生成區(qū)細(xì)胞促凋亡通路被激活,抑制血管生成,對(duì)斑馬魚胚胎心血管發(fā)育具有毒性作用。 綜上所述,納米粒子可通過引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、改變酶的活性、影響基因表達(dá)、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路或線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡,造成斑馬魚毒性損傷。

2.3 影響基因表達(dá)

目前有研究表明,斑馬魚體內(nèi)基因的表達(dá)情況會(huì)受納米粒子影響,對(duì)斑馬魚造成毒性損傷。 Gao等[33]將50 nm 的nano-Ag 作用于斑馬魚胚胎,研究顯示,nano-Ag 可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路基因表達(dá),使酪氨酸激酶(Src)受抑制,磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)通路中Akt 磷酸化,抑制血管生成,導(dǎo)致斑馬魚胚胎血管發(fā)育的異常遲緩,造成胚胎發(fā)育毒性。 Ladhar 等[35]將斑馬魚暴露于粒徑為8 nm 和50 nm 的硫化鎘納米顆粒(CdSNPs)中,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA 標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)PCR 基因毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示CdSNPs 可使RAPD 探針的雜交位點(diǎn)數(shù)量明顯改變,即基因組發(fā)生改變,引起線粒體功能障礙。 Du 等[29]將斑馬魚胚胎暴露于三種濃度(12.5、25、50 mg/L)的 nano-ZnO 中,結(jié)果表明Bax、p53、Caspase-3、Caspase-9 等凋亡通路相關(guān)基因均出現(xiàn)顯著上調(diào),而抗凋亡基因Bcl-2 顯著下調(diào),引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡,造成顯著的胚胎毒性。 Sheng 等[19]將四種濃度(5,10、20、40 μg/L)的nano-TiO2連續(xù)45 d 作用于成年斑馬魚,結(jié)果顯示,nano-TiO2可顯著激活C-fos、C-jun、Bdnf基因表達(dá),抑制p38、Ngf、Creb、Nr1、NR2ab、GluR2 基因表達(dá),對(duì)斑馬魚大腦產(chǎn)生一定程度的損傷,具有神經(jīng)毒性。以上研究表明,納米材料影響斑馬魚基因的表達(dá)是納米材料引起斑馬魚毒性損傷的重要機(jī)制之一。

2.4 細(xì)胞周期

近年來有研究研表明,納米粒子可以通過影響斑馬魚細(xì)胞周期,影響斑馬魚的生長(zhǎng)發(fā)育。 Hou等[36]將 nano-ZnO 作用于斑馬魚胚胎,研究發(fā)現(xiàn),nano-ZnO 可抑制細(xì)胞周期蛋白(Cycs)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的表達(dá),使微脂質(zhì)體(MCM)被破壞,激活了 Cyc/CDK 復(fù)合物(CycD/CDK4,6；CycE/CDK2；CycA/CDK2),使細(xì)胞周期的不同時(shí)期(G1 期、M 期和 G2 期)均受到影響,導(dǎo)致 DNA 復(fù)制紊亂,個(gè)體的細(xì)胞分裂、分化、增殖等正常活動(dòng)及DNA 合成和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移功能受到干擾,造成一定程度的細(xì)胞毒性作用。

3 納米材料對(duì)斑馬魚的毒性影響因素

有研究表明,納米粒子的化學(xué)組成、粒徑、濃度或劑量、形狀、給藥方式以及納米材料的制備方法等,都可以影響納米材料對(duì)機(jī)體的毒性。

3.1 化學(xué)組成

Xiong 等[25]將兩種粒徑相同(50 nm)而化學(xué)組成不同的納米粒子(nano-TiO2、nano-ZnO)作用于成年斑馬魚(作用濃度為5 mg/L、50 mg/L),檢測(cè)斑馬魚在鰓、消化道及肝的各項(xiàng)指標(biāo)(SOD、CAT、GSH、MDA),表明5 mg/L 的nano-ZnO 對(duì)斑馬魚的毒性作用要顯著強(qiáng)于5 mg/L nano-TiO2,另外5 mg/L 的nano-ZnO 和50 mg/L 的nano-TiO2對(duì)斑馬魚的毒性效應(yīng)幾乎相當(dāng),說明在相同粒徑、相同濃度下,nano-ZnO 的毒性要顯著大于 nano-TiO2。 Liu 等[37]分別將200 μg/mL 的 SiO2納米球和 C-QDs 作用于6 hpf的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明SiO2納米球會(huì)引起胚胎嚴(yán)重的畸形,而經(jīng)C-QDs 處理的斑馬魚胚胎則能夠正常發(fā)育,其畸形率與對(duì)照組基本相同。 因此,C-QDs較SiO2納米球的致畸毒性小。

3.2 濃度或劑量

Zhu 等[28]將三種不同濃度(25、50、100 mg/L)的nano-SiO2作用于2 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明,nano-SiO2濃度越大,對(duì)斑馬魚胚胎體內(nèi)的ROS 含量影響越大,引起斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激也越嚴(yán)重。 Souza 等[14]將成年斑馬魚分別暴露于三種濃度(2、10、20 mg/L)的氧化石墨烯(GO)中,研究顯示,GO 可使肝細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、核固縮、形成液泡、細(xì)胞破裂和壞死,作用濃度越高,肝細(xì)胞損傷越顯著。段延芳[13]將 6 種濃度(0、25、50、200、400 μg/mL)的三種上轉(zhuǎn)換納米材料(鉺離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+,Er3+)、銩離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+,Tm3+)、鉺離子與鐿離子相摻的四氟釓鈉(NaGdF4:Yb3+,Er3+)分別作用于24 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明,其半數(shù)致死量為200 μg/mL,隨作用濃度的增大,斑馬魚胚胎的畸形率和死亡率都隨之增加。

3.3 粒徑

通常情況下,粒徑越小的納米粒子毒性越強(qiáng)。Zhu 等[28]將兩種不同粒徑(15 nm,30 nm)的nano-SiO2作用2 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明nano-SiO2粒徑越小,聚集在斑馬魚胚胎內(nèi)的納米粒子就越多,排出的時(shí)間也越長(zhǎng),毒性效應(yīng)越顯著。 李翔[22]將斑馬魚受精卵暴露于兩種不同粒徑(15 nm、50 nm)濃度范圍在(50～1000 μg/mL)的納米二氧化硅(nano-SiO2),研究顯示,在處理濃度相同時(shí),15 nm(小粒徑組)的nano-SiO2更易被機(jī)體攝取,富集含量更多,造成的毒性影響也更顯著,斑馬魚受精卵的死亡率和畸形率也顯著增加。

3.4 形狀

Hua 等[38]將不同形狀的nano-ZnO(納米球、納米棒、亞微米立方體型)作用于斑馬魚胚胎,研究表明,不同形狀的nano-ZnO 可造成不同程度的胚胎毒性,其中納米棒的毒性作用最強(qiáng),其機(jī)制可能為納米棒結(jié)構(gòu)尖而細(xì),對(duì)生物膜有較強(qiáng)的損傷和破壞能力,且可以延長(zhǎng)其在機(jī)體內(nèi)分布時(shí)間,難以代謝排除,對(duì)機(jī)體造成較強(qiáng)毒性作用。 Ispas 等[39]將樹枝狀和球形的納米Ni 作用于斑馬魚,經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn),樹枝狀的納米Ni 在斑馬魚體內(nèi)的停留時(shí)間要遠(yuǎn)長(zhǎng)于球形納米Ni,使樹枝狀納米Ni 在體內(nèi)分布的量更多,其毒性效應(yīng)也越顯著,對(duì)斑馬魚的腸道和骨骼肌造成嚴(yán)重的組織損傷。

3.5 給藥方式

Kang 等[11]分別將(0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL)的C-QDs 溶液通過微注射法和浸泡法作用于斑馬魚胚胎。 實(shí)驗(yàn)表明,通過微注射法和浸泡法給藥的(0.5、1.0、1.5 mg/mL)組的胚胎存活率均超過80%,通過浸泡法給藥的2.5 mg/mL 組存活率為60%,而通過微注射法給藥的2.5 mg/mL 組存活率僅為55%。 說明,在相同的作用劑量下,微注射法比浸泡法對(duì)斑馬魚胚胎有更強(qiáng)的毒性損傷。

3.6 制備方法

Peng 等[40]分別將將自頂向下法和自底向上法合成的碳點(diǎn)(C-dots)通過微注射法作用于受精后6 d 的斑馬魚胚胎腹腔。 結(jié)果顯示,自頂向下法合成的C-dots 可在斑馬魚骨骼中大量沉積,即對(duì)鈣化骨具有極好的親和力。 而自底向上法合成的C-dots則并不能再骨骼中觀察到,即無骨親和特性。 自頂向下法合成的C-dots 與斑馬魚骨骼良好的親和性可能與其制備過程中表面產(chǎn)生的大量極性基團(tuán)有關(guān)。

綜上所述,通常情況下,在其他變量都相同時(shí):粒徑越小的納米粒子毒性越強(qiáng)；濃度或劑量越大毒性越強(qiáng)；不同化學(xué)組成的納米粒子性質(zhì)差異較大,如不含金屬的納米材料(如碳量子點(diǎn)等)較含金屬或金屬氧化物的納米粒子毒性小,引起的毒性效應(yīng)和毒性機(jī)制不甚相同；不同形狀的納米粒子也可能具有不同的毒性機(jī)制；納米材料制備方法的差異抑或是給藥方式的差異都可導(dǎo)致不同的體內(nèi)效應(yīng)。但目前對(duì)于納米粒子毒性機(jī)制的研究尚不深入,影響納米粒子毒性的因素依然有待探討。

4 結(jié)語

目前,斑馬魚作為毒理學(xué)研究的重要模式生物,已經(jīng)在環(huán)境毒理學(xué)、胚胎發(fā)育毒理學(xué)當(dāng)中得到了十分廣泛的研究和應(yīng)用,因其具備的許多哺乳動(dòng)物所沒有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),斑馬魚在納米毒理學(xué)中日益受到各國專家學(xué)者的重視。 當(dāng)前大部分關(guān)于斑馬魚的納米毒理學(xué)研究主要集中在毒性機(jī)制(如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)改變等)和毒性效應(yīng)(如對(duì)消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的損傷),但由于大部分研究仍然停留在表面,而且不全面、不徹底,人們對(duì)納米粒子的毒性機(jī)制和影響毒性因素依然所知甚微。 未來,納米粒子使斑馬魚各個(gè)系統(tǒng)損傷的發(fā)生損傷的具體分子機(jī)制是一個(gè)重要的研究方向[41-42],另外,如何降低納米粒子的毒性作用、對(duì)納米粒子的安全粒徑、濃度或劑量范圍的尋找依舊需要不斷研究探索,為納米粒子在臨床應(yīng)用打下重要基礎(chǔ)。