張 娜劉學(xué)芳馮素香董浩然

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046)

2018 年中國癌癥登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,2014 年我國肺癌總體發(fā)病人數(shù)78.2 萬,死亡人數(shù)62.6 萬,肺癌發(fā)病率與死亡率位居癌癥首位[1]。轉(zhuǎn)移是肺癌治療失敗和患者死亡的首要原因,骨轉(zhuǎn)移是肺癌的常見并發(fā)癥之一,其中非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)24 個月時骨轉(zhuǎn)移的累積發(fā)病率為23.8%,小細胞肺癌為18.5%[2]。隨著現(xiàn)代治療技術(shù)水平的提升,肺癌患者的5 年生存率顯著提高,同時骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生風險也隨之增加[3]。肺癌骨轉(zhuǎn)移好發(fā)部位在脊柱和軀干骨近端,腫瘤對脊柱的損傷常導(dǎo)致頑固性局部疼痛、病理性骨折或脊柱畸形,壓迫脊髓可導(dǎo)致根性疼痛、無力行走或四肢癱瘓[4]。為了深入研究肺癌骨轉(zhuǎn)移的病理生理學(xué)機制,建立可重復(fù)的、與臨床密切相關(guān)的肺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型至關(guān)重要,同時肺癌治療藥物的研發(fā)在進入人類臨床試驗之前,也需要動物模型來檢測和評估。本文對國內(nèi)外關(guān)于肺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型的相關(guān)文獻進行整理,從肺癌細胞株的選擇、實驗動物的選擇、肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法、模型評價4 個方面進行綜述,以期為肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)研究提供參考。

1 肺癌細胞株的選擇

骨是一個非常特殊的組織,質(zhì)地堅硬,由骨基質(zhì)、細胞和纖維組成,基質(zhì)內(nèi)富含膠原纖維、蛋白聚糖和糖蛋白,同時有大量的羥基磷灰石結(jié)晶沉積,細胞包括成骨細胞、破骨細胞、骨祖細胞和骨細胞[5]。其中與肺癌骨轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的是破骨細胞與成骨細胞,破骨細胞在骨發(fā)育過程中可溶解吸收骨質(zhì),參與骨的生長和改建,但在腫瘤因素的誘導(dǎo)下破骨細胞異常活躍,可降解膠原纖維,導(dǎo)致骨溶解和骨破壞[6]。成骨細胞可合成骨基質(zhì)成分,在腫瘤因素的誘導(dǎo)下可形成骨刺或?qū)е鹿趋雷冃?。肺癌骨轉(zhuǎn)移模型中采用的肺癌細胞株應(yīng)能夠在骨微環(huán)境中生存,具備黏附骨基質(zhì)和促進破骨細胞形成的能力[7],能夠誘導(dǎo)破骨細胞降解膠原纖維及蛋白聚糖[4]。根據(jù)現(xiàn)有的報道,用于建立肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的細胞株包括與動物同種來源的瘤株和異種來源的瘤株(人源肺癌細胞株)。

1.1 動物源肺癌細胞株

Lewis 肺癌細胞株(LLC) 是 1980 年從小鼠Lewis 肺癌中分離得到的細胞系,LLC 細胞株在C57BL/6J 小鼠體內(nèi)具有高度的致瘤性和轉(zhuǎn)移性[8],應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)修飾可轉(zhuǎn)染熒光素酶基因,在小鼠體內(nèi)表達熒光信號,常用于肺癌轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建。

1.2 人源肺癌細胞株

已報道的用于肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的包括人肺腺癌細胞系、小細胞肺癌細胞系和非小細胞肺癌細胞系。其中人肺腺癌細胞系包括PC9 細胞、A549 細胞、PC-14 細胞、SPC-A-1 細胞和 H1299;小細胞肺癌細胞系包括H446 細胞和SBC-5 細胞;非小細胞肺癌細胞系為NSCLC 細胞。

2 實驗動物選擇

報道顯示肺癌骨轉(zhuǎn)移模型使用最多的是嚙齒動物小鼠,免疫缺陷型小鼠能夠接受不同物種來源的組織或腫瘤移植物,不會產(chǎn)生排斥反應(yīng),廣泛應(yīng)用于肺癌移植瘤模型[9]。有相關(guān)文獻報道的用于肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的小鼠品系包括:裸鼠、SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠、BNX(NIH-Beige-Nude-XID)小鼠、NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠、C57BL/6J 小鼠。其中,裸鼠是胸腺缺乏的小鼠品系,無胸腺、無T 淋巴細胞,可用于研究同種或異種腫瘤細胞的移植[10-11];SCID 小鼠嚴重缺乏B和T 細胞,對異種的腫瘤細胞或組織的抑制效果優(yōu)于裸鼠,更適合人類肺癌細胞的移植[12],但隨著鼠齡的增加,T、B 細胞功能可部分恢復(fù),成為影響模型的重要因素;BNX 小鼠是一種T、B 和NK 細胞聯(lián)合免疫缺陷的小鼠,該品系小鼠應(yīng)用于肺癌移植模型成瘤率高,成瘤時間早,實驗重復(fù)性好[13];NOD/SCID 小鼠T、B 細胞聯(lián)合免疫缺陷,NK 細胞減少、無循環(huán)補體、異種移植人源肺癌細胞后能夠保留其病理學(xué)特征[9]; C57BL/6J 小鼠是標準的近交系小鼠,免疫功能正常,常用于Lewis 肺癌模型的構(gòu)建,腫瘤成活率高,轉(zhuǎn)移率高,常用于肺癌藥物的評價[14-15]。

3 肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法

3.1 左心室注射法

楊順芳等[16]將人肺腺癌SPC-A-1 細胞(1×106個/只)經(jīng)左心室注射的方法接種于 8 ～10 周齡SCID 小鼠,120 d 在放射性核素示蹤下約10%小鼠可檢出骨轉(zhuǎn)移,分離培養(yǎng)骨轉(zhuǎn)移灶細胞,再次經(jīng)左心室注射接種于BNX 小鼠體內(nèi),經(jīng)過3 次BNX 小鼠體內(nèi)循環(huán)接種后,最終在接種后23 d,BNX 小鼠骨轉(zhuǎn)移率高達100%,轉(zhuǎn)移可見于顱骨、顎骨、脊柱、四肢骨和肋骨等。儲建軍等[17]將人肺腺癌PC9 細胞(熒光素酶標記)通過左心室注射接種于4 ～5 周裸鼠體內(nèi),細胞濃度為 1×105/100 μL,30 d IVIS 活體成像跟蹤檢查在小鼠脛骨處出現(xiàn)肺癌溶骨性轉(zhuǎn)移灶,X 射線檢查(X-ray)顯示小鼠脛骨發(fā)生溶骨性缺損。崔永奇等[18]將 4 種肺腺癌細胞系 A549、H1299、SPC-A-1、XL-2 細胞(1×106個/只),采用左心室注射的方法接種于6～8 周齡的BLAB/c- nu/nu裸鼠體內(nèi),接種后裸鼠出現(xiàn)消瘦,脊柱彎曲等癥狀,經(jīng)Micro CT 和病理學(xué)分析確定4 種肺腺癌細胞骨轉(zhuǎn)移率分別為60%、40%、50%、40%,骨轉(zhuǎn)移平均周期為(33±1)d、(57±4)d、(32±3)d、(15±2)d,各實驗組中軸骨轉(zhuǎn)移的概率顯著高于四肢長骨,與臨床肺癌骨轉(zhuǎn)移的部位特點相吻合。Cai 等[19]將A549細胞(1×105個/只)采用左心室注射的方法接種至裸鼠體內(nèi),建立裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移模型,經(jīng)過三次體內(nèi)篩選后,分離出一個克隆株A549 L6,生物發(fā)光成像顯示該克隆株誘導(dǎo)的脊柱轉(zhuǎn)移率高達80%,40 d 裸鼠出現(xiàn)神經(jīng)壓迫癥狀。

Dieterly 等[20]將 NSCLC 細胞經(jīng)心內(nèi)注射接種于裸鼠體內(nèi),結(jié)果顯示約39%的小鼠出現(xiàn)自發(fā)性椎體轉(zhuǎn)移、脊髓壓迫和后肢癱瘓,組織學(xué)顯示椎體轉(zhuǎn)移灶為肺腺癌表型,腫瘤上皮細胞排列成索狀或腺泡狀,免疫組化和免疫熒光分析顯示,椎體轉(zhuǎn)移灶中波形蛋白表達增加,該研究成功構(gòu)建了具有自發(fā)性椎體轉(zhuǎn)移性肺癌裸鼠模型。

3.2 脛骨注射

俞惠新[21]采取右后肢脛骨貼骨注射的方法,將小細胞肺癌 H446 細胞(2×106個/只)接種于 6 周齡BALB/c-nu/nu 雄性裸鼠體內(nèi),10 周 X-ray 及病理檢查均顯示H446 細胞引起明顯的脛骨破壞,病灶周圍有廣泛的反應(yīng)性骨生成,骨髓中有腫瘤細胞侵入。王靜等[22]將 A549 細胞(6×106個/只)注射到4 ～6 周齡雄性NOD/SCID 小鼠脛骨外貼骨處,6周后,X-ray 顯示肺癌細胞已浸潤到脛骨及周圍軟骨組織,并且發(fā)生典型的腫瘤侵襲和骨質(zhì)破壞,病理顯示脛骨髓腔中有腫瘤細胞浸潤,周圍骨質(zhì)不完整。

通過短暫免疫抑制,在免疫功能正常C57BL/6J小鼠體內(nèi)也能成功復(fù)制肺癌骨轉(zhuǎn)移模型,孟越等[23]采用環(huán)磷酰胺(150 mg/kg)腹腔注射1 次,結(jié)合地塞米松鈉(100 mg/kg)連續(xù)注射3 次(1 次/天,連續(xù)3 d)的方法,使有正常免疫功能的C57BL/6J小鼠免疫力下降,第 5 天將 A549 細胞(2×108個/只)注入小鼠右后肢脛骨平臺,7 d 可見接種處腫脹、呈球形,14 d 腫瘤影響后肢運動,28 d 8 只存活,7 只成瘤。X-ray、Micro CT 和病理分析均證實 A549 細胞對免疫抑制小鼠右后肢脛骨的損傷,該研究證實具有正常免疫功能的小鼠在免疫抑制后建立肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的可行性。

3.3 尾靜脈注射

Otsuka 等[24]采取尾靜脈注射的方法,將ACCLC-319/bone2 細胞接種至NOD/SCID 小鼠體內(nèi),28 d 小鼠肺、肝和骨均發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移,X-ray 檢測到溶骨性病變,35 d 檢測到成骨病變,組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)骨刺。Miki 等[25]將小細胞癌細胞系SBC-5 細胞經(jīng)尾靜脈注射接種于NOD/SCID 小鼠體內(nèi),經(jīng)X-ray評估,28 d 檢測到SBC-5 細胞產(chǎn)生的溶骨性骨轉(zhuǎn)移,所有小鼠在第35 天出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。

3.4 尾動脈注射

Kuchimaru 等[26]將熒光素酶標記的LLC/luc 細胞,采用尾動脈注射的方法接種到C57BL/6 小鼠體內(nèi),生物熒光報告成像顯示在注射后30 min,骨髓中即可檢測到熒光素酶活性信號,7 d 骨髓轉(zhuǎn)移灶數(shù)目增加,14 d 小鼠后肢骨出現(xiàn)較大的轉(zhuǎn)移灶,X-ray和Micro CT 檢測顯示,14 d 小鼠骨量出現(xiàn)明顯下降,32 d LLC/luc 細胞轉(zhuǎn)移灶主要出現(xiàn)在小鼠后肢骨和囊狀腺中,小鼠生存期超過32 d。尾動脈注射可一次性注入1×106個癌細胞,不會造成小鼠急性死亡,進入尾動脈的癌細胞在短時間內(nèi)可經(jīng)髂總動脈進入股動脈,使癌細胞進入骨髓,最終增加在下肢骨成功轉(zhuǎn)移的機會。

4 模型評價方法

4.1 臨床癥狀

肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移至脊柱可導(dǎo)致步態(tài)異常、后肢不能站立或下肢截癱。小鼠脊柱損傷的程度可使用巴松-貝蒂-布雷斯納漢量化評分表(BBB)進行評分[27],該評分系統(tǒng)包括將動物置于開闊場地,觀察其步態(tài)4 min,以0 ～21 之間的分數(shù)積分,其中21 分是正常,0 分是完全癱瘓。Tatsui 等[28]將肺腺癌PC-14 細胞鉆孔植入裸鼠L-3 椎體內(nèi),建立脊柱轉(zhuǎn)移模型,使用 BBB 對裸鼠運動功能進行每日評分,1 ～14 d,BBB 平均分數(shù)從21 下降到19,裸鼠從正常帶尾行走到拖尾行走(里程碑事件1);15 ～20/21 d(左腿/右腿),BBB 平均分數(shù)從19 下降到14,動物步態(tài)變差,出現(xiàn)背步(里程碑事件2);22 ～26/27 d(左腿/右腿),BBB 平均分數(shù)從14 下降到8,動物行走漸進性困難,僅出現(xiàn)后肢掃動(里程碑事件3);29 ～36 d,BBB 平均分數(shù)從8 下降到0,裸鼠進展到癱瘓(里程碑事件4)。

4.2 影像學(xué)檢測

X 射線檢查(X-ray)、微計算機斷層掃描技術(shù)(micro computed tomography,Micro CT)、小動物正電子發(fā)射斷層顯像系統(tǒng)(micro positron emission tomography-computed tomography,Micro PET-CT)技術(shù)、單光子發(fā)射計算機斷層掃描(single photon emission computed tomography,SPECT)都是常規(guī)用于肺癌動物模型診斷的影像學(xué)技術(shù),其中以X-ray應(yīng)用最為廣泛[21],可顯示小鼠骨骼總體形態(tài)學(xué)變化,優(yōu)點是操作簡單,造價低;缺點是對早期或小腫瘤的檢測并不敏感;Micro CT 與X-ray 相比,分辨率高、圖像不重疊、不偽影,能在活體情況下成像,還可進行骨密度評估、骨體積計算和三維重建[18];Micro PET-CT 是專門為研究人類疾病的小動物模型而設(shè)計的,其主要目標是能提供與人相似的活體分子影像學(xué),18F-FDG 是PET 最常用的顯像劑,將18F-FDG 經(jīng)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),活動35 min后,麻醉動物Micro PET-CT 靜態(tài)掃描,病灶處可檢測明顯的占位性病變[29];99Tcm-MDP 全身骨顯像技術(shù)結(jié)合SPECT 檢測用于肺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型的檢測[21],反應(yīng)原理是:亞甲基二膦酸鹽(99Tcm-MDP)可化學(xué)吸附與羥基磷灰石晶體表面,通過有機質(zhì)與未成熟的骨膠原結(jié)合而沉積在骨骼內(nèi)。將99Tcm-MDP 經(jīng)尾靜脈注入裸鼠,SPECT 檢測可見骨腫瘤灶有明顯的放射性濃聚。

4.3 生物熒光報告成像

生物熒光報告成像是動物腫瘤模型中新興的成像方式,用熒光素酶轉(zhuǎn)染肺癌細胞株[17],檢測前腹腔或靜脈注射熒光素酶底物,病灶幾分鐘內(nèi)可產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,使用IVIS 活體成像可以多時間點、動態(tài)監(jiān)測到體積約為0.5 mm3的微小轉(zhuǎn)移灶,比X-ray更敏感。缺點是檢測時間較長,儀器精密度要求高,需要注入熒光素酶底物,實驗成本高[30]。

4.4 病理學(xué)診斷

石蠟切片技術(shù)結(jié)合HE 染色,仍然是診斷小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的金標準,光鏡下可以觀察到肺癌骨轉(zhuǎn)移灶的形態(tài)、分布及浸潤情況,常與影像學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用,用于模型的評價。病理學(xué)診斷的缺點是需要將動物處死,實驗步驟繁瑣,周期長。

5 結(jié)語

綜上所述,構(gòu)建肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的方法不斷豐富,研究者可根據(jù)其研究目的選擇合適的細胞株及實驗動物,在造模方法上應(yīng)打破傳統(tǒng)思路,如:心內(nèi)注射、尾靜脈注射以及脛骨注射,多探索新的造模方法,如:尾動脈注射和免疫抑制后造模等。肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的評價可綜合臨床癥狀、影像學(xué)及病理學(xué)結(jié)果綜合評價,針對能表達熒光素酶的肺癌細胞株IVIS 活體成像也是動態(tài)的、良好的評價方法。隨著我國科研條件的不斷提升,許多高端的影像學(xué)技術(shù),如:Micro PET-CT、SPECT、IVIS 活體成像,在未來發(fā)展中也應(yīng)受到研究者的廣泛關(guān)注。