佟 巍郭 智劉子洋潘思丹高 虹向志光

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要對(duì)自身攜帶的微生物進(jìn)行控制,我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物和寄生蟲監(jiān)測(cè)做出了規(guī)定[1-2]。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行控制是微生物控制的有效的,也是必要的條件[3]。目前我國(guó)清潔級(jí)以及SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大、小鼠需要飼養(yǎng)在屏障環(huán)境或是隔離環(huán)境中。獨(dú)立通風(fēng)籠具(individual ventilated cages,IVC)是應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)的設(shè)備,其自身可以為動(dòng)物提供潔凈空氣,同時(shí)維持與外界的靜壓差,可有效控制氣流走向。

每個(gè)IVC 籠盒可以視為一個(gè)小型的隔離器,但其與隔離器又有一些區(qū)別。主要區(qū)別在于,隔離器中飼養(yǎng)的動(dòng)物,其日常的飲水、飼料、墊料的更換是無菌傳遞進(jìn)行的,人與動(dòng)物不直接接觸;而IVC 籠具在進(jìn)行此類操作時(shí),需要借助一個(gè)層流微環(huán)境,如生物安全柜或是換籠機(jī)等,在此類設(shè)備中需打開籠盒后進(jìn)行換籠等操作,人和動(dòng)物有直接接觸,人員操作是IVC 籠具更換時(shí)微生物感染的主要風(fēng)險(xiǎn)。因此,有必要對(duì)IVC 換籠進(jìn)行規(guī)范化的管理。

本文對(duì)我單位制定的IVC 換籠標(biāo)準(zhǔn)操作程序的實(shí)施效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在ABSL-2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi),用小鼠易感病毒病原模擬感染實(shí)驗(yàn),對(duì)同一設(shè)施環(huán)境中不同位置籠具內(nèi)哨兵動(dòng)物感染病原情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè),進(jìn)而測(cè)試使用該標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)Σ《靖腥撅L(fēng)險(xiǎn)控制的有效性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所ABSL-2 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠,6 周齡,(18±2)g,共 38 只,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004],按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用經(jīng)過中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(XZG18001)。

1.1.2 病原

小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)A59株源自美國(guó)ATCC,本室保存。

1.2 主要試劑

75%乙醇、“84”消毒液、QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN,Cat.No.52904);One Step RT-PCR Kit(Solarbio,T2240);MHV 病毒抗體免疫熒光法(Immunofluorescent antibody,IFA)檢測(cè)細(xì)胞抗原玻片(本室自制);MHV 病毒抗體酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒(蘇州西山生物技術(shù)有限公司,IM-692C)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

動(dòng)物分為四組,分別為人工感染組、同籠架相鄰籠具哨兵組、相間籠架哨兵組,同設(shè)施內(nèi)IVC 系統(tǒng)外哨兵組。人工感染組20 只,其他各組6 只/組。人工感染組小鼠進(jìn)行灌胃感染,使用病毒劑量為100TCID50。人工感染每周進(jìn)行一次,共 4 次。各哨兵組同期飼育,僅在程序規(guī)定時(shí)間進(jìn)行換籠操作。

1.3.2 IVC 籠具換籠標(biāo)準(zhǔn)操作程序

小鼠在實(shí)驗(yàn)前3 d 進(jìn)入設(shè)施,感染后,所有組動(dòng)物每周進(jìn)行換籠操作。IVC 籠具換籠標(biāo)準(zhǔn)操作程序基本內(nèi)容簡(jiǎn)述如下:(1)使用生物安全柜或換籠機(jī)等設(shè)備進(jìn)行籠具更換;(2)不同組別的動(dòng)物在操作時(shí)應(yīng)該保持時(shí)間和空間的距離,若無法做到空間隔離操作時(shí),應(yīng)以時(shí)間間隔來區(qū)分不同感染風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物組。即不同組動(dòng)物使用同一換籠設(shè)備時(shí),不同時(shí)操作,期間保證時(shí)間間隔,在對(duì)換籠設(shè)備進(jìn)行消毒同時(shí)保證操作空間的自凈;(3)動(dòng)物籠具表面、操作臺(tái)面等使用有效消毒劑消毒處理。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物籠具表面使用75%醫(yī)用消毒乙醇噴灑消毒,操作臺(tái)面使用有效氯含量250 mg/L 的“84”消毒液擦拭后使用紫外燈照射消毒30 min;(4)對(duì)籠具內(nèi)動(dòng)物及籠具的接觸做好風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和處置,避免飲水、墊料、飼料在不同籠具間的交叉接觸。

1.3.3 小鼠血清中抗 MHV 抗體的 IFA 和 ELISA檢測(cè)

在小鼠感染3 周及5 周分別采集動(dòng)物全血,4℃過夜后離心分離血清,血清經(jīng)56℃滅活30 min 后進(jìn)行MHV 病毒抗體檢測(cè)。MHV 病毒抗體檢測(cè)使用自行制備的MHV 細(xì)胞抗原[4-6]及商品化的ELISA 試劑盒進(jìn)行[5,7]。

1.3.4 小鼠糞便樣品MHV 核酸檢測(cè)

人工感染病毒組小鼠采集急性感染期糞便樣品,各哨兵組小鼠采集實(shí)驗(yàn)5 周后糞便樣品,使用病毒RNA 核酸提取試劑盒提取病毒RNA 樣品,采用針對(duì)MHV 的PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)[8]。

2 結(jié)果

2.1 ABSL-2 實(shí)驗(yàn)設(shè)施和IVC 設(shè)備的運(yùn)行參數(shù)

本實(shí)驗(yàn)在ABSL-2 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物飼養(yǎng)間僅本實(shí)驗(yàn)相關(guān)人員能夠進(jìn)入。飼養(yǎng)間與相鄰準(zhǔn)備間的靜壓差設(shè)定為-20 Pa,與外界的絕對(duì)靜壓差為-45 Pa。實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度等均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010 對(duì)小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的要求。IVC 設(shè)備籠盒與外界的壓力梯度設(shè)定為-10 Pa?；\盒內(nèi)換氣次數(shù)達(dá)每小時(shí)50 次。

2.2 人工感染組小鼠病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)

人工感染做小鼠感染后第6 天采集糞便樣品,MHV 病原 PCR 檢測(cè)可見 MHV 陽性擴(kuò)增。感染病毒3 周后,隨機(jī)采集3 只小鼠全血,收集血清,IFA法與ELISA 法分別進(jìn)行MHV 抗體檢測(cè)全部為陽性,IFA 法測(cè)定抗體滴度為 1:80～1 ∶160。

感染5 周后,采集剩余小鼠樣品,IFA 法與ELISA 法檢測(cè),MHV 抗體均為陽性,IFA 法測(cè)定抗體滴度為 1 ∶640 ～ 1 ∶2560。糞便樣品 PCR 檢測(cè),MHV 均有陽性擴(kuò)增。

2.3 各哨兵組小鼠病原學(xué)和血清學(xué)均無陽性檢出

實(shí)驗(yàn)感染5 周后,采集各對(duì)照組動(dòng)物糞便樣品進(jìn)行MHV 核酸檢測(cè),各樣品均無MHV 特異擴(kuò)增。采集各對(duì)照組小鼠全血,使用ELISA 和IFA 兩種方法進(jìn)行MHV 抗體檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均為陰性(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)終末點(diǎn)各組MHV 檢測(cè)結(jié)果Table 1 Viral detection at the terminal point of the experiment

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是一類特殊的動(dòng)物,為了對(duì)其自身攜帶病原進(jìn)行控制,需要使用物理屏障將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與感染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行隔離。通常采用屏障設(shè)施,或隔離設(shè)備來實(shí)現(xiàn)[3]。IVC 籠具的最大優(yōu)勢(shì)在于可在有限的空間內(nèi)飼養(yǎng)不同組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。該類設(shè)備本身為每個(gè)籠盒內(nèi)的動(dòng)物均提供了獨(dú)立的通風(fēng),每個(gè)獨(dú)立的IVC 籠盒可以作為一個(gè)單獨(dú)的系統(tǒng),用于飼養(yǎng)不同分組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。理論上不同組動(dòng)物飼養(yǎng)在不同的IVC 籠盒中,它們之間不存在微生物交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。但是此類設(shè)備在動(dòng)物籠具墊料更換,飼料、飲水添加等過程中,需要使用公用的換籠設(shè)備。由于換籠操作多在同一空間,當(dāng)使用同一設(shè)備進(jìn)行換籠,動(dòng)物之間仍存在一定的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IVC 籠具換籠的標(biāo)準(zhǔn)操作程序其控制的重點(diǎn)就在于對(duì)此交叉感染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行識(shí)別與控制。

既往的研究表明,在生物安全柜中的換籠操作有一定的交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[9],需要對(duì)換籠的具體操作做出標(biāo)準(zhǔn)操作程序的規(guī)定。如安全柜內(nèi)潔凈區(qū)與污染區(qū)的分區(qū)。接觸IVC 籠具內(nèi)材料的操作對(duì)于更換手套的要求等。本文采用的標(biāo)準(zhǔn)操作程序其要點(diǎn)在于將不同感染風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物進(jìn)行分組操作。利用時(shí)間距離,實(shí)現(xiàn)對(duì)不同組動(dòng)物交叉感染風(fēng)險(xiǎn)的控制。MHV 病原極易傳播,特別是A59 株既可通過消化道也可以通過呼吸道感染動(dòng)物。本文做小鼠人工感染實(shí)驗(yàn),感染6 d 后小鼠糞便就有MHV 核酸檢出,此時(shí),該動(dòng)物已具有傳播病原的風(fēng)險(xiǎn);在感染3 周時(shí),人工感染小鼠已發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)化。各哨兵組動(dòng)物與人工感染組共同飼育5 周時(shí)間,期間進(jìn)行了4 次換籠操作。在充分的暴露周期內(nèi),哨兵組動(dòng)物糞便沒有MHV 核酸檢出,也沒有發(fā)生MHV 抗體血清學(xué)轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,獨(dú)立通風(fēng)籠具的這種換籠標(biāo)準(zhǔn)操作程序技術(shù)要求在小鼠病毒性病原感染風(fēng)險(xiǎn)的控制上是有效的。