郭 嬌，楊海玉，龍 偉

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 放射醫(yī)學研究所藥物室，天津300192

電離輻射直接作用或產生活性氧，使細胞中的DNA、蛋白質等生物大分子發(fā)生結構和功能變化，進而導致細胞凋亡和壞死，對增殖旺盛的器官影響尤為嚴重[1]。當受到大于1 Gy的高劑量率輻射后機體會發(fā)生急性輻射綜合癥，臨床上主要表現(xiàn)為造血系統(tǒng)和胃腸道功能障礙[2]。目前臨床上可用的輻射防護劑很少，基于抗氧化原理研發(fā)的阿米福汀安全窗窄、不良反應嚴重，細胞因子療法作用單一、易致癌，中藥治療作用靶點不明確、可控性低，使其在臨床上的應用受到限制，迫切需要開發(fā)高效低毒的輻射防護劑[2-4]。2008年，Burdelya等[5]基于腫瘤細胞的抗凋亡機制，發(fā)現(xiàn)了一種Toll樣受體 （Toll-like receptor，TLR）5的激動劑，通過激動TLR5激活下游的核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），進而減少受照小鼠、恒河猴體內骨髓和胃腸道的細胞凋亡，提高受照小鼠和恒河猴的存活率，相比其他已有輻射防護劑，輻射防護效果更好、不良反應更低。自此，TLR激動劑在輻射方面的應用開始成為研究的熱點。

TLR及其產生輻射防護的機制

TLR是一類模式識別受體，是哺乳動物先天免疫系統(tǒng)的一部分，能識別病原相關分子模式 （pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）或宿主來源的損傷相關分子模式 （damage-associated molecular patterns，DAMPs）。識別PAMPs/DAMPs后，TLR的胞內區(qū)發(fā)生構象改變，從而募集一系列含有Toll/白介素 （interleukin，IL）-1受體結構域的胞內接頭蛋白，如髓樣分化因子 88 （myeloid differentiation factor 88， myd88）、誘導干擾素-β（interferon-β， IFN-β） 包含 Toll/白介素1受體結構域的接頭分子，然后啟動下游信號傳遞，包括NF-κB、促分裂原活化蛋白激酶和干擾素調節(jié)因子，進而促進DNA損傷修復基因表達、抗氧化和抗凋亡相關細胞因子表達、干擾素上調等，從而能對抗輻射后的DNA損傷、細胞凋亡和繼發(fā)感染[2，4，6-7]。1996年，Lemaitre等[8]首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)了該類受體。目前，已經報道了10種人類TLR（TLR1-TLR10）和12種小鼠 TLR（TLR1-TLR9和 TLR11-TLR13）。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10位于質膜中，可識別微生物細胞壁和細胞膜成分，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要位于細胞內的隔室中，可識別核酸配體[9]。

TLR2和TLR4

TLR2和TLR4都表達在細胞膜表面，通過形成二聚體參與配體的識別。

TLR2與TLR1、TLR6定位于4號染色體，在外周血白細胞中高表達，其信使RNA在單核/巨噬細胞中表達頗豐[10]。TLR2能夠分別與TLR1或TLR6形成異源二聚體，識別其配體，TLR2/6在輻射防護方面的研究比TLR1/2多[6]。對TLR2/6激動劑的研究始于支原體脂肽，基于其起作用的N端結構，先后人工合成的脂肽有 CBLB601、CBLB612、CBLB613。CBLB613劑量減少因子 （為1.25）高、給藥窗寬、給藥劑量低和免疫原性低，與CBLB601、CBLB612相比，具有更高的輻射防護活性、更低的毒性[2，11-12]。CBLB613刺激粒細胞集落刺激因子 （granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IL-6、角質細胞趨化劑等細胞因子大量分泌，促進骨髓造血細胞和外周血細胞的恢復，照射前24 h或12 h和照射后6 h或1 h單次給藥0.015 mg/kg，受9.2 Gy60Coγ射線照射的CD2F1小鼠的30 d存活率均為100%[12]。與CBLB613結構相似的合成成纖維細胞刺激脂肽也通過激動TLR2/6產生輻射防護作用，其比平行實驗的其他幾種TLR的激動劑更高效，是副作用最小的TLR2激動劑[13]。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)另一種激動TLR2的微生物，熱殺傷結核分枝桿菌，增加CD34+造血干細胞的數量，減輕受照小鼠骨髓和睪丸的輻射損傷，令人感興趣的是它能降低炎癥相關因子的表達，使Th1/Th2趨于平衡，抑制炎癥反應的發(fā)生。另外，一些微生物的細胞壁成分也被報道通過激動TLR2產生輻射防護作用，如肽聚糖在增強放療誘導的抗腫瘤作用和減少放療對腸道的不良反應方面具有臨床相關性[15]，一種從酵母細胞壁中提取的多糖酵母聚糖-A促進了受照小鼠造血系統(tǒng)的恢復[16]，鼠李糖乳酸桿菌釋放的脂磷壁酸保護腸上皮細胞免受輻射損傷[17]。

TLR4位于9號染色體，通過與自身形成同源二聚體識別其配體[6]。人們對TLR4的研究較早[18]，但其在輻射防護方面的研究晚于TLR5。2013年，Liu等[19]發(fā)現(xiàn)敲除TLR4的小鼠對輻射更加敏感，將脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）注射到正常小鼠體內，可在體內激動TLR4以myd88依賴的方式激活NF-κB，減輕受照小鼠的輻射損傷。然而LPS毒性嚴重，限制了其臨床應用，單磷酸脂質A是一種低毒的TLR4激動劑，其能保護骨髓，減輕輻射對脾臟和免疫失調的損害，使睪丸和腸道免受輻射損傷[20]。Xu等[21]發(fā)現(xiàn)熱滅活的鼠傷寒沙門氏菌 （heat-killed salmonella typhimurium，HKST）以TLR4依賴的方式保護小鼠免受輻射損傷。HKST實質上是一種TLR2、TLR4和TLR5的協(xié)同激動劑，TLR2和TLR4識別HKST細胞壁成分，如肽聚糖和LPS，TLR5識別細胞外鞭毛蛋白，其顯著抑制輻射誘導的DNA損傷和細胞凋亡，減輕小鼠骨髓、腸道、睪丸、脾臟和肺的輻射損傷，并且抑制輻射所致的Th1向Th2的轉變，阻止炎癥反應的發(fā)生，提高受照小鼠的存活率[21-22]。

多種TLR2和TLR4的激動劑均已在動物水平被證明在輻射前后給藥均有效，且優(yōu)于已被FDA批準的阿米福汀和G-CSF，它們免疫原性低，不會引起炎癥反應，相比TLR5在體內廣泛表達，且由于協(xié)同激動作用，給藥劑量小，可與CBLB502相媲美且有可能突破CBLB502的組織局限性，具有很大的臨床應用潛力。另外，雖然CBLB612（H6101）與輻射防護相關的文章還沒有發(fā)表，但查到的資料顯示克利夫蘭生物實驗室已經完成Ⅱ期臨床研究，用于接受阿霉素-環(huán)磷酰胺化療的乳腺癌患者的骨髓抑制預防 （https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02778763）。

TLR5

TLR5位于1號染色體，表達受限制，主要在腸道、肝臟和膀胱。2008年，Burdelya等[5]基于腫瘤細胞的抗凋亡機制，發(fā)現(xiàn)TLR5的激動劑CBLB502（恩托莫德）具有輻射防護作用，其是一種經過藥理優(yōu)化的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物。CBLB502通過激動TLR5以myd88依賴的方式激活NF-κB，可誘導快速而短暫地產生高水平的G-CSF、IL-6、IL-8和IL-10等抗凋亡的細胞因子，而腫瘤壞死因子-α、IL-1β和IL-2等促炎因子的表達處于低水平，其也能促進抗氧化因子超氧化物歧化酶2的表達。CBLB502不僅保護腸道固有層和隱窩細胞，也保護骨髓造血干細胞和早期祖細胞。13 Gy全身照射 （total body irradiation， TBI） 前30 min按0.2 mg/kg給小鼠注射CBLB502可使存活率達到87%，此照射劑量下阿米福汀的有效給藥劑量已接近最大耐受劑量。對9 Gy的TBI，CBLB502照射前24 h和照射后1 h給藥均起效。另外，CBLB502對局部輻射損傷也有效，對頭頸部腫瘤放療的小鼠模型的上皮損傷有緩解作用，也可以改善輻射所致的小鼠睪丸損傷。并且CBLB502不會使腫瘤細胞的放射敏感性降低，也不會因為抑制細胞凋亡而提高癌癥的發(fā)生率，同時實驗證明其不會產生耐受性。CBLB502相比其他已有輻射防護劑，輻射防護效果更好、不良反應更低[5，23-25]。肝臟是CBLB502發(fā)揮輻射防護作用的中心，是CBLB502作用的主要靶器官，被激動后會激活多種促生存和免疫調節(jié)信號通路，并使分泌因子譜和免疫細胞含量發(fā)生顯著變化，造血祖細胞的輻射保護也依賴于肝細胞分泌的因子[26]。雖然鞭毛蛋白的毒性遠大于CBLB502，但同年Vijay-Kumar等[27]證實鞭毛蛋白在照射前2 h至照射后4 h給藥均可產生輻射防護作用。通過建立TLR5介導的NF-κB篩選模型，再與鞭毛蛋白的作用對照，發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺 （polyethylenimine，PEI）通過激動TLR5產生輻射防護作用。PEI的作用機制與鞭毛蛋白非常相似。然而，由于相對分子質量比鞭毛蛋白小，PEI可能比鞭毛蛋白具有更高的藥理特異性、更低的有效劑量、更容易到達靶點、更便于保存[28]。研究者們對CBLB502做了很多改造，以求得到更加高效低毒的輻射防護藥物。2016年，胡顯文等[29]獲得CBLB502-Fc融合蛋白及其制備方法的專利，該融合蛋白包括CBLB502蛋白和免疫球蛋白Fc片段，活性高、穩(wěn)定性好、半衰期長。2019年，報道了一種新型TLR5激動劑KMRC011在致死性輻射小鼠中具有輻射保護活性，其本質是CBLB502的修飾物，利用泛素特異性蛋白酶，選擇性地將34個可以引起免疫應答的氨基酸殘基從CBLB502中剪切出來而得[30]。此外，也報道了一些植物藥通過激動TLR5產生輻射防護作用，如植物凝集素-L蛋白[31]和黑茶提取物[32]。

TLR5激動劑是在輻射防護方面研究最早的，且CBLB502是唯一一個被FDA授予研究新藥 （investigational new drug，IND）地位的TLR激動劑，進入FDA批準的快速通道，已完成Ⅱ期臨床研究，有望成為上市藥物應用于頭頸部腫瘤放射治療的輻射防護[2，33]。

TLR7、TLR8和TLR9

TLR7和TLR8均位于x染色體，TLR9位于3號染色體，三者高度同源，與其他報道的TLR成員不同，它們是在基因組數據庫中確定的[34]。它們主要在細胞內的囊泡表達，如內質網、內涵體、溶酶體和內溶酶體。除了能夠識別含有DNA及RNA的自身抗原外，TLR7和TLR8可識別外源單鏈RNA病毒和小分子咪唑并喹啉衍生物，TLR9能識別DNA來源的DNA病毒和細菌[6]。TLR7激動劑可作為腫瘤放射治療的佐劑，放療聯(lián)合TLR7激動劑與單純放療相比，提高了淋巴瘤模型小鼠的存活率。與TLR4和TLR9的激動劑相比，TLR7的激動劑更有效地促進DC和NK細胞向小鼠淋巴結中聚集并誘導CD4+和CD8+效應T細胞生成，增強Th1型細胞免疫反應的能力。其中TLR7激動劑均是小分子咪唑并喹啉衍生物，有瑞喹莫德、咪喹莫特和TMX-101。TLR8在輻射防護方面的應用報道較少，但瑞喹莫德同時激動TLR7和TLR8[35-36]。CpG-寡脫氧核苷酸 （CpG-oligodeoxynucleotides，CpG-ODN）作為一種合成的類似細菌DNA的物質，被證明可通過激動TLR9產生輻射防護作用，可使TBI引起的骨髓損傷減輕，重建造血功能，提高受照小鼠的存活率[37]。為了提高CpG-ODN的活性和靶向性，可以考慮將其包裝成納米顆粒。Kobiyama等[38]生成了一種新的納米連接的K型 CpG-ODN（K3），它由非激動性的樹突狀細胞相關性C型植物凝集素-1配體裂裥多糖包裹，即K3-裂裥多糖，在免疫治療中顯示更高的輔助活性，但在輻射防護方面報道較少。目前，TLR7、TLR8、TLR9在輻射防護方面的研究較少，以后可以做出更多嘗試。

綜上，本文對在輻射防護方面已有研究的TLR的激動劑進行了梳理和討論，表明TLR激動劑是最有潛力的輻射防護劑。電離輻射對人體造成的損傷是不容忽視的，然而由于國防、工業(yè)和醫(yī)療的需要，部分人群可能會受到電離輻射。被批準用于臨床的只有阿米福汀和G-CSF，而阿米福汀安全窗窄、僅輻射前給藥有效，嚴重時會造成嘔吐、一過性低血壓和昏迷，G-CSF作用單一、需多次注射，并會引起骨髓增生和敗血癥[1-2，4，33]。本文綜述的各種TLR的激動劑均較二者顯示了更高的優(yōu)越性，照射前后給藥均有效且給藥窗寬，CBLB502照射前24 h和照射后1 h給藥均起效[5]，CBLB613照射前48 h至照射后6 h給藥均起效[12]。TLR激動劑還能誘導高水平的輻射防護相關細胞因子的短暫升高，如G-CSF和IL-6，這些細胞因子促進骨髓造血細胞、外周血細胞的再生，升高外周血細胞如白細胞、血小板等的最低值，縮短外周血細胞低于正常值的持續(xù)時間。TLR激動劑也誘導抗氧化細胞因子的產生。有趣的是，TLR激動劑不會引起促炎細胞因子高表達，并抑制輻射所致的Th1向Th2的轉變，阻止炎癥反應的發(fā)生。另外，雖然TLR激動劑的輻射防護作用是基于腫瘤細胞的抗凋亡機制被發(fā)現(xiàn)的，但卻不會降低腫瘤細胞的放射敏感性，也不會增加癌癥的發(fā)生率。在輻射防護方面，CBLB502是唯一一個具有IND的TLR激動劑，但由于對其研究既基于靶點也基于表型，所以相較另外7個具有輻射防護作用的IND藥物更具潛力，目前已完成Ⅱ期臨床研究，有望成為上市藥物應用于頭頸部腫瘤放療的輻射防護[33]。為了研究更加高效低毒的輻射防護劑，TLR協(xié)同激動劑將成為一個重要的研究方向。