周婧瑤，張 鈺，胡 琦，陳雪蓮，楊麗涓，蘇星月，歐明才

(四川省婦幼保健院，四川 成都 610045)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥是最常見的人類酶缺陷遺傳病之一，該病常在某些誘因(食用蠶豆、藥物，感染)下發(fā)病，臨床表現(xiàn)為急性溶血性貧血及高膽紅素血癥，是新生兒病理性黃疸的主要原因，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致核黃疸，造成智力低下，甚至死亡[1]，成為影響人口素質(zhì)的重要問題之一。四川省新生兒篩查中心于2014年12月開始面向全省開展新生兒G6PD缺乏癥篩查及確診工作，現(xiàn)對篩查情況和基因突變類型進(jìn)行分析，以便為進(jìn)一步提高本地區(qū)的人口素質(zhì)和規(guī)范新生兒疾病篩查的管理水平及完善有效的干預(yù)措施提供決策依據(jù)。

1研究對象與方法

1.1研究對象

本研究樣本來源于四川省新生兒篩查中心片區(qū)市縣醫(yī)療機(jī)構(gòu)的新生兒遺傳代謝病篩查資料。2014年12月至2017年12月共計(jì)篩查新生兒229 091例，其中男118 651例，女110 440例。

1.2研究方法

1.2.1 G6PD缺乏癥新生兒篩查

在新生兒監(jiān)護(hù)人知情同意的情況下，新生兒于出生72小時(shí)并充分哺乳6次后，由培訓(xùn)合格的專業(yè)醫(yī)務(wù)人員取其足后跟血，制成干血斑，通過郵政快遞送至新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室集中檢測。采用G6PD熒光定量分析法(芬蘭Ani labsystems公司新生兒G6PD檢測試劑盒，芬蘭Ani labsystems公司BIOTEKFLX-800熒光分析儀)進(jìn)行G6PD酶活性測定。以G6PD<2.8U/g血紅蛋白為篩查陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 G6PD缺乏癥酶學(xué)診斷

召回篩查陽性的可疑患兒，采集其靜脈血2mL(乙二胺四乙酸抗凝)，測定紅細(xì)胞G6PD酶活性(奧林巴斯AU2700全自動(dòng)生化分析儀，寧波美康生物科技公司的連續(xù)監(jiān)測速率法)，當(dāng)紅細(xì)胞G6PD<1 700U/L(兒童正常參考值1 700～2 600U/L)診斷為G6PD缺乏癥。

1.2.3 G6PD基因熱點(diǎn)變異分析

采用廈門致善生物科技股份有限公司Lab-Aid820核酸提取Micro試劑及核酸提取儀對初篩陽性患兒的干血斑樣本DNA進(jìn)行提取。采用熒光PCR熔解曲線技術(shù)(廈門致善生物科技股份有限公司G6PD基因突變檢測試劑盒及熒光定量PCR)進(jìn)行G6PD基因12種中國人熱點(diǎn)變異(c.95A>G，c.383T>C，c.392G>T，c.487G>A，c.517T>C，c.592C>T，c.871G>A，c.1004C>A，c.1024C>T，c.1360C>T，c.1376G>T，c.1388G>A)定性檢測。

1.2.4 G6PD基因直接測序

利用Sanger測序?qū)Τ鹾Y陽性但基因熱點(diǎn)變異分析陰性的高度疑似G6PD缺乏癥的樣本進(jìn)行序列分析，進(jìn)一步明確是否存在非熱點(diǎn)變異。

1.3比較指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)所檢測標(biāo)本中各型突變的比例，以了解本地區(qū)G6PD基因熱點(diǎn)突變的分布情況；根據(jù)基因診斷陽性、陰性樣本的酶學(xué)法檢出率，以評價(jià)基因診斷與酶學(xué)診斷兩種方法在G6PD診斷中的應(yīng)用。

2結(jié)果

2.1 G6PD缺乏癥新生兒篩查情況分析

229 091例新生兒干血斑G6PD酶活性中位數(shù)為8.79U/g血紅蛋白。最小為0，最大為30.60U/g血紅蛋白。以G6PD<2.80U/g血紅蛋白為陽性切值，共檢出陽性1 169例，其中男1 028例，女141例，男：女為7.3∶1，G6PD缺乏癥新生兒篩查陽性率為0.51%，其中男性為0.87%(1 028/118 651)，女性為0.13%(141/110 440)。在初篩檢出的陽性病例中，有206例患者進(jìn)行了基因診斷，276例進(jìn)行了G6PD酶學(xué)診斷，182例同時(shí)進(jìn)行了G6PD酶學(xué)診斷與基因診斷，另外505例為失訪患者。

2.2 G6PD缺乏癥新生兒篩查陽性的基因診斷

2.2.1基因熱點(diǎn)變異分析

在篩查陽性高?；純褐?，182例(男153例、女29例)通過基因熱點(diǎn)變異檢測進(jìn)行確診。在153例男性新生兒中檢出122例半合子變異，男性G6PD缺乏癥篩查陽性與G6PD基因熱點(diǎn)變異診斷符合率為79.74%(122/153)。在29例進(jìn)行G6PD基因熱點(diǎn)變異分析的女性新生兒中，有9例檢出變異，女性G6PD缺乏癥篩查陽性與G6PD基因熱點(diǎn)變異診斷符合率為31.03%(9/29)。

2.2.2 G6PD基因測序

對51例(男31例，女20例)篩查陽性但熱點(diǎn)變異檢測陰性的高度疑似患兒的樣本進(jìn)行G6PD基因測序。在31例未檢出熱點(diǎn)變異的男性新生兒中，發(fā)現(xiàn)5例存在4種半合子變異類型，分別為2例c．406C>T、1例c.703C>T、1例c.835A>T及1例c.1311C>T變異，均為已知致病變異，其余26例男性及20例女性均未檢出異常。

2.2.3 G6PD缺乏癥基因變異特點(diǎn)及患病率

在上述進(jìn)行基因檢測的182例篩查陽性者中，通過熱點(diǎn)變異共檢出9種變異，分別為c.1004C>A 2例、c.1024C>T 19例、c.1376G>T 46例、c.1388G>A 34例、c.487G>A 4例、c.517T>C 1例、c.871G>A 10例、c.95A>G 10例、c.392G>T 5例。結(jié)合G6PD基因測序結(jié)果，共檢出136例G6PD基因變異，變異類型13種，四川地區(qū)G6PD基因變異率為74.73%(136/182)，男性新生兒為83.01%(127/153)，女性新生兒為31.03%(9/29)。根據(jù)基因變異檢出率推測，四川地區(qū)G6PD缺乏癥男性患病率約為0.72%(853/118 651)，女性約為0.04%(44/110 440)。

2.3酶學(xué)診斷與基因診斷的數(shù)據(jù)分析

本研究同時(shí)運(yùn)用了G6PD酶學(xué)診斷方法對182例篩查陽性的高?；純哼M(jìn)行了酶活性檢測，分別統(tǒng)計(jì)基因診斷陽性、陰性樣本的酶學(xué)法檢出率，作為酶學(xué)診斷與分子診斷兩種方法比較的依據(jù)。在G6PD基因診斷中共檢出陽性136例，其中酶活性陽性者123例(男119例，女4例)，酶活性正常者13例(男8例，女5例)；在46例基因診斷未檢出異常者中，酶活性陽性者21例(男17例，女4例)，酶活性正常者25例(男9例，女16例)。與G6PD基因診斷方法比較，G6PD酶學(xué)診斷的敏感度為90.44%(123/136)，男性新生兒為93.70%(119/127)，女性新生兒為44.44%(4/9)；陽性預(yù)測值為85.42%(123/144)，男性新生兒為87.50%(119/136)，女性新生兒為50.00%(4/8)。

3討論

3.1篩查情況分析

G6PD缺乏癥是人類最常見的單基因遺傳病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該病在全球約有3.5億例患者，其分布與瘧疾的選擇性有關(guān)，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國呈“南高北低”的分布特點(diǎn)，患病率為0.20%～44.80%[2]。該病主要以預(yù)防為主，而如何在人群中進(jìn)行科學(xué)有效的篩查就成為預(yù)防工作的重點(diǎn)。本研究通過熒光分析法，對229 091例新生兒干血斑G6PD酶活性進(jìn)行定量測定，篩查陽性率為0.51%，根據(jù)基因變異檢出率推測，四川省G6PD缺乏癥男性新生兒患病率約為0.72%，女性新生兒約為0.04%，雖遠(yuǎn)低于廣東(3.70%)、廣西(7.40%)等高發(fā)地區(qū)[3]，但與四川省新生兒疾病篩查的先天性甲狀腺功能低下癥(CH)及苯丙酮尿癥(PKU)的患病率相比(PKU為1∶16 488,CH為1∶2 339)，該病仍屬于四川地區(qū)的高發(fā)病種之一，因此，本研究從新生兒篩查角度探討四川地區(qū)G6PD缺乏癥的遺傳學(xué)特征，并以基因診斷為依據(jù)，評估現(xiàn)有的新生兒篩查和酶學(xué)診斷的性能，為衛(wèi)生行政部門提供決策依據(jù)。

3.2基因情況分析

G6PD基因定位于X染色體上，以X染色體連鎖不完全顯性方式遺傳，因基因突變導(dǎo)致紅細(xì)胞G6PD酶活性降低而發(fā)病[4]。本研究通過分子診斷的方法，共檢出13種變異類型，所有變異均為已知變異，其中5種常見變異為c.1376G>T、c.1388G>A、c.1024C>T、c.95A>G、c.871G>A，共占檢出變異位點(diǎn)的90.84%，主要以c.1388G>A、c.1376G>T及c.1024C>T為主，占總比例的76.34%，其次是c.871G>A及c.95A>G。c.1388G>A基因突變率高于c.1376G>T突變率，成為四川地區(qū)的主要基因突變類型，且本研究結(jié)果顯示c.95A>G并非為本地區(qū)最常見的3種G6PD基因突變類型之一，這與蔡望偉、楊昭慶等相繼于2001年對廣東、廣西、云南、貴州、海南、臺灣的報(bào)道以及余超等[5]對重慶地區(qū)的報(bào)道存在差異，說明不同地區(qū)不同人群的G6PD基因突變譜不同，提示我省應(yīng)根據(jù)自己的基因突變譜制訂突變熱點(diǎn)檢測的納入范圍，并將高發(fā)位點(diǎn)作為重要的突變熱點(diǎn)進(jìn)行檢測。

3.3確診方法比較

G6PD缺乏癥男性患者為半合子，基因突變攜帶者即為患者，表現(xiàn)為G6PD酶重度缺乏，通過酶活性檢測很容易查出[6]。本研究通過酶學(xué)診斷男性新生兒的敏感度為93.70%，是女性新生兒的2.1倍，該結(jié)果與其他篩查中心[7]報(bào)道的G6PD熒光斑點(diǎn)法篩查陽性率和診斷符合率結(jié)果基本一致，提示酶學(xué)檢測用于男性患兒診斷的靈敏性及特異性均很高。

由于該病的遺傳特點(diǎn)，女性患兒可發(fā)生兩條X染色體上的G6PD同時(shí)突變或其中一條隨機(jī)失活的情況，因此，酶缺乏的紅細(xì)胞與正常紅細(xì)胞嵌合的比率存在差異，體內(nèi)酶活性可呈現(xiàn)顯著降低，也可以在正常范圍內(nèi)。本研究女性新生兒的酶學(xué)診斷與基因診斷相比，陽性預(yù)測值僅為50.00%，證明分子診斷的敏感性更高，通過基因檢測可明顯提高女性患兒的檢出率，降低女性雜合子的漏檢率。雖然G6PD酶活性正常的女性攜帶者無臨床表現(xiàn)和自身患病風(fēng)險(xiǎn)，但可將致病性突變遺傳給子代，增加子代新生兒早期高膽紅素血癥及急性溶血風(fēng)險(xiǎn)，提高女性攜帶者檢出率對指導(dǎo)遺傳咨詢具有一定的指導(dǎo)意義。

對于本研究中的21例酶活性異常但基因檢測未見突變位點(diǎn)的患兒，考慮存在因其他病因造成的G6PD酶活性繼發(fā)性異常或存在未知新的基因突變位點(diǎn)的可能，后期應(yīng)繼續(xù)跟蹤隨訪，有待進(jìn)一步研究原因。

綜上所述，目前我省開展的新生兒G6PD缺乏癥篩查及診斷的檢查工作是具有可行性的，對于患兒的早期診斷及有效干預(yù)意義重大。酶學(xué)檢測方法簡單、快速，可作為男性患兒的確診依據(jù)；女性雜合子因酶活性變化較大，酶學(xué)診斷的檢出率低，因此，為防止女性患兒的漏診，建議開展新生兒G6PD缺乏癥的分子診斷。后期應(yīng)進(jìn)一步分析突變熱點(diǎn)與酶活性的相關(guān)性，以便根據(jù)不同檢測對象，選用合理的診斷方法，實(shí)現(xiàn)最高效地檢出陽性患兒。