王明煬 湛佳興 周 琦 劉慶陽 徐凱智

華北理工大學附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科 河北唐山 063000；①應急總醫(yī)院

骨折是重癥監(jiān)護室(ICU)患者死亡的原因之一?；颊咴谑状稳胱CU時通常會出現(xiàn)非感染性全身炎癥反應[1]。在創(chuàng)傷后炎癥反應中存活的患者通常由于細菌重復感染而引起膿毒癥[2]。傳統(tǒng)上認為骨折可導致膿毒癥，然而希臘人發(fā)現(xiàn)早期合并多發(fā)傷的膿毒癥患者的存活率高于無多發(fā)傷的患者，并且認為IL-10的釋放可能是膿毒癥患者預后良好的原因之一[3]。研究表明，調(diào)節(jié)性樹突細胞(CD11c-CD45RBhigh DCs)可以從存在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF-α和IL-10的骨髓細胞中提取，活化后分泌高水平的IL-10。與正常DC產(chǎn)生促炎性細胞因子不同，CD11c-CD45RBhigh DCs產(chǎn)生較少的促炎細胞因子，且優(yōu)先產(chǎn)生IL-10[4]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者假設(shè)，骨折通過激活先天免疫，促進骨髓增殖分化，增加CD11c-CD45RBhigh DCs的數(shù)量對膿毒癥小鼠起到保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 選擇6～8周齡的小鼠并且體質(zhì)量約20g的雄性C57BL / 6小鼠(購自北京中國醫(yī)學科學院實驗動物中心)。在20℃～22℃，濕度(55±5)%的環(huán)境下分開飼養(yǎng)1周，維持正常的晝夜規(guī)律，不限制水和食物的攝入。

1.1.2實驗儀器與試劑 培養(yǎng)皿、剪刀、離心機、細胞過濾器、流式細胞儀、超凈臺、CO2培養(yǎng)箱、膠原酶D溶液、生物素化的小鼠樹突細胞富集混合物、RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100IU/mL和鏈霉素100IU/mL)。

1.2實驗②方法 ①創(chuàng)傷模型制作：用戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉，小鼠仰臥位固定在操作臺上，在平行于腹部左腹內(nèi)斜肌和左腹橫肌的皮膚上形成4～5mm的小切口，分離開肌肉與血管暴露股骨干，用持針鉗碾碎股骨干，然后分層進行縫合。假手術(shù)是指只進行血管肌肉的分離，不進行骨折操作。②膿毒癥模型制作：采用腹腔注射致死菌方式制作膿毒癥模型，對C57BL/6小鼠(6～8周)進行腹腔注射107CFU多重菌(小鼠腸內(nèi)容物培養(yǎng)所得)。A組進行致死菌腹腔注射；B組進行假手術(shù)然后進行致死菌腹腔注射；C組進行創(chuàng)傷模型制作緊接著進行致死菌腹腔注射。自由進食飲水，保持正常的晝夜節(jié)律變化，觀察病死率變化。③獲取骨髓細胞和肝細胞的免疫細胞：使用25號針頭從小鼠的脛骨和股骨中吸出骨髓細胞。將肝臟和骨髓細胞的沉淀物重懸于PBS 1%牛血清白蛋白中，然后調(diào)節(jié)至1×106個細胞/ mL，并通過熒光激活細胞分選儀分析在明亮的綠色細胞上進行分析。在2～3mL LRPMI 1640中獲得外周血并用紅細胞溶素處理。離心后，收集沉淀細胞。將分離的肝臟置于具有足夠膠原酶D溶液的6cm培養(yǎng)皿中以完全覆蓋培養(yǎng)皿的底部。然后使用1mL注射器和25G針頭向肝臟注射膠原酶D溶液，并使用一把鋒利的剪刀將組織切成小塊。將肝臟在膠原酶D溶液中于37℃溫育0.5小時，并在柱塞的幫助下將其輕輕地通過細胞過濾器。通過Ficoll Paque分離肝臟免疫細胞。④從骨髓、肝臟中純化CD11c-CD45RBhigh DCs：先前研究已經(jīng)詳細介紹了CD11c-CD45RBhigh DCs的制備方法[5]。簡而言之，采用小鼠樹突狀細胞富集- DM 技術(shù)，從骨髓細胞和肝臟免疫細胞中陰性選擇這些DC。在純化的DCs中，使用生物素化抗小鼠CD11c單克隆抗體和IMag鏈霉親和素顆粒對CD11c-CD45RBhigh DCs進行負選擇。流式細胞儀檢測CD11c-細胞純度達95%以上。采用流式細胞儀(FACS Aria II)分離骨髓和肝臟CD11c-CD45RBhigh DCs。采用熒光活化細胞分選法(FACS)測定CD11c-CD45RBhigh DCs的純度為>98%。

1.3實驗分組 創(chuàng)傷后膿毒癥實驗：A組(n=10)：單純致死菌感染；B組(n=10)：假手術(shù)加致死菌感染；C組(n=10)：骨折創(chuàng)傷加致死性菌感染。觀察A、B、C各組在致死菌攻擊下的病死率，分別在0、3、7、14天4個時間點獲取骨髓和肝臟細胞，并觀察其數(shù)量變化。

2 結(jié)果

2.1各組膿毒癥小鼠的病死率比較 通過對3組病死率的變化發(fā)現(xiàn)，B和C組與A組相比病死率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。C組與B組相比病死率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可見骨折與假手術(shù)組都能降低膿毒癥小鼠的病死率，其中骨折組病死率降低得更加顯著，見圖1。

圖1 各組膿毒癥小鼠病死率比較

2.2骨髓細胞和肝臟細胞以及其中的CD11c-CD45RBhigh DCs的數(shù)量變化比較 骨髓細胞：第3天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組與B組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第7天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組與B組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他時間點各組相比均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

骨髓細胞中CD11c-CD45RBhigh DCs：第3天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組與B組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第7天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組與B組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第14天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他時間點各組相比細胞數(shù)量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

肝細胞第3和第7天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第7天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組與B組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他時間點各組相比均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

肝細胞中的CD11c-CD45RBhigh DCs第3和第7天C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第7天：C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組與B組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第14天：C組與A組相比細胞變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他時間點各組相比均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1～4。

表1 骨髓中免疫細胞數(shù)量比較

表2 骨髓中CD11c-CD45RBhigh DCs數(shù)量變化比較

表3 肝臟中免疫細胞數(shù)量變化比較

表4 肝臟中CD11c-CD45RBhigh DCs數(shù)量變化比較

3 討論

創(chuàng)傷性損傷會破壞皮膚等大屏障，也會破壞細胞膜等微屏障，從而導致多種危險分子的釋放,這種破壞引起了一個快速激活的先天免疫反應的開始[6]。這些介質(zhì)稱為損傷相關(guān)的分子模式(DAMP)：線粒體DNA，組蛋白，高遷移率族蛋白1(HMGB1)和熱休克蛋白[7，8]，一些受體如toll樣受體(TLR)或晚期糖基化終產(chǎn)物的受體識別這些介質(zhì)[9-11]。當人體單核細胞或巨噬細胞在體外暴露于某些病原體相關(guān)分子模式(PAMP)或危險相關(guān)分子模式(DAMP)，并在1周后用非相關(guān)病原體再刺激時，它們顯示出增強的促炎細胞因子的產(chǎn)生[12]。先天免疫細胞中這種非特異性記憶的誘導被稱為“訓練性免疫”[13，14]。已經(jīng)充分證明樹突細胞(DCs)是專業(yè)的抗原呈遞細胞(APCs)，在先天免疫中起關(guān)鍵性作用，未成熟的DCs在炎癥組織中捕獲和處理抗原，并在炎癥微環(huán)境中發(fā)展為具有上調(diào)主要組織相容性復合體(MHC)和共刺激小分子的成熟DCs[15]，隨后進入次級淋巴組織，將處理后的抗原呈現(xiàn)給幼稚T細胞，從而有效地產(chǎn)生效應T細胞[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：骨折后膿毒癥小鼠的病死率明顯降低，說明骨折通過激活先天免疫改善膿毒癥小鼠的預后。

作為第一道防線，先天免疫系統(tǒng)能夠檢測和應對各種各樣的危險，包括傳染性疾病、無菌性炎癥和惡性轉(zhuǎn)化[17]。在1993年，DeMaria和他的同事發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素抵抗的C3H/HeJ小鼠菌株也能抵抗出血性休克引起的死亡，這使得微生物免疫識別和損傷識別之間的相似性受到人們的廣泛關(guān)注[18]。研究已經(jīng)表明由創(chuàng)傷而產(chǎn)生的DAMPs和由病原微生物感染而產(chǎn)生的PAMPs都可以通過模式識別受體(PRRs)，如TLRs、NLRs、RAGE、嘌呤能受體或補體受體，將其信號傳遞給白細胞[19-21]。曾有研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射CD11c-CD45RBhighDCs可以顯著抑制熱損傷誘導的促炎性細胞因子的產(chǎn)生并降低病死率[22]；來自內(nèi)毒素耐受小鼠的CD11c-CD45RBhighDCs可減輕實驗性急性肝衰竭[23]。2016年，美國醫(yī)學會(JAMA)將膿毒癥(SEPSIS)定義為宿主對感染的反應失調(diào)導致的一種危及生命的器官功能障礙[24]。筆者的實驗結(jié)果表明當骨折發(fā)生后CD11c-CD45RBhigh DCs的數(shù)量明顯增加，所以筆者認為：當機體再受到PAMPs(致死菌)攻擊時，由于有DAMPs預先刺激，此時機體既能迅速引起炎癥因子的釋放抑制細菌感染加重；機體預先產(chǎn)生的CD11c-CD45RBhigh DCs能夠抑制過度炎癥反應從而維持機體免疫狀態(tài)平衡，所以CD11c-CD45RBhigh DCs的存在是骨折明顯地降低了膿毒癥小鼠的病死率的主要原因。

在實驗中筆者對骨折組的骨髓細胞和肝細胞以及其中的CD11c-CD45RBhigh DCs進行計數(shù)：骨折后骨髓細胞和肝細胞數(shù)以及其中的CD11c-CD45RBhigh DCs在前3天內(nèi)數(shù)量低于正常小鼠，之后逐漸升高并在骨折后第7天達到高峰。骨折后第7天細胞數(shù)逐漸減少至第14天降至對照水平。在第7天和第14天之間細胞數(shù)量均高于正常水平。因此筆者認為骨折引起先天免疫的保護作用與適應性免疫不同，有一定的時限：骨折后3天內(nèi)不僅對機體無保護作用，而且會明顯增加膿毒癥小鼠的病死率；骨折后第7天保護作用最強，此后逐漸減弱至第14天時基本降到正常水平。這也解釋了部分骨折患者會導致膿毒癥的原因，大致是因為在骨折后前3天未能對其進行充分的抗感染治療，使其在免疫力較低的情況下受到了病原微生物的沖擊；類似的在骨折后第7天過度應用激素類抗炎藥抑制了正常的免疫反應，也大大降低了機體的免疫屏障。因此在臨床治療當中，避免臨床治療與護理措施限制了免疫反應的作用，需要充分考慮患者不同的免疫狀態(tài)對患者進行及時和個性化管理。

雖然在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)了骨折對膿毒癥小鼠的保護作用，但在部分個體中筆者發(fā)現(xiàn)在實驗操作中出現(xiàn)失血和骨折創(chuàng)傷程度嚴重的情況下，反而達不到預期的保護作用。因此，筆者推測當創(chuàng)傷程度較小時，對機體的第二次打擊起到保護作用會與創(chuàng)傷的嚴重程度成正比；相反的若創(chuàng)傷非常嚴重時，小鼠會死于免疫功能低下期間。在未來研究中大家可以通過創(chuàng)傷的數(shù)據(jù)化對機體的免疫狀態(tài)以及患者預后進行有效的預測。