杜楠楠 汪引芳 張 鵬 劉宗軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062)

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制、自我更新并且能夠保持未分化狀態(tài)的多潛能細(xì)胞，主要受Notch、Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、骨形態(tài)蛋白(BMP)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等在內(nèi)的多條信號(hào)通路的調(diào)控。近年來(lái)，中藥對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，多種中藥通過(guò)調(diào)節(jié)Notch通路，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、腫瘤干細(xì)胞(CSCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)等多種干細(xì)胞的增殖、分化、凋亡產(chǎn)生重要影響。茲將中藥調(diào)控干細(xì)胞Notch信號(hào)通路的研究進(jìn)展綜述如下。

1 Notch信號(hào)通路的構(gòu)成

Notch通路是一條傳導(dǎo)途徑高度保守的信號(hào)通路，由Notch基因調(diào)控。Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體即Delta-Serrate-Lag(DSL)蛋白、DNA結(jié)合蛋白、Notch的調(diào)節(jié)分子和其他效應(yīng)物等組成。在哺乳動(dòng)物中，Notch通路涉及4個(gè)異寡聚單通道Ⅰ型跨膜受體Notch1～Notch4，以及5個(gè)DSL家族配體:Jagged1(JAG1)和Jagged2(JAG2)，Deltalike1(DLL1)、Deltalike3(DLL3)和Deltalike 4(DLL4)，這5個(gè)DSL家族配體均屬于Serrate配體家族[1]。配體和受體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)2次蛋白水解切割，釋放出Notch細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，然后與配體一起，被配體表達(dá)細(xì)胞內(nèi)吞，并被γ-分泌酶復(fù)合物切割，產(chǎn)生活性片段，即Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)。短壽命的NICD被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，易位到細(xì)胞核中，并與轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL結(jié)合以代替輔阻遏復(fù)合物。核受體輔阻遏物(N-CoR)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)在復(fù)合物中被共激活因子(Maml)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT，p300)取代。p300的HAT功能使染色質(zhì)松弛，導(dǎo)致RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物的募集，以啟動(dòng)Notch下游靶基因發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(HES)、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子相關(guān)抑制蛋白(HERP)等堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[2-3]。

2 中藥基于Notch信號(hào)通路對(duì)BMSCs的調(diào)控

BMSCs是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。近幾年報(bào)道指出，Notch通路在BMSCs的分化和增殖中發(fā)揮著重要作用[4-6]。中藥通過(guò)調(diào)控Notch通路來(lái)影響B(tài)MSCs的增殖和分化主要有以下方式：某些中藥通過(guò)激活Notch通路，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等分化，或抑制BMSCs來(lái)源的軟骨細(xì)胞的肥大和增生；有些中藥通過(guò)抑制Notch通路，促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分化。

2.1 中藥激活Notch通路調(diào)控BMSCs的增殖和分化 有研究表明，雙氫青蒿素抑制間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化的軟骨細(xì)胞標(biāo)志物[包括核轉(zhuǎn)錄因子SOX9和Ⅱ型膠原纖維α1基因(Col2A1)]的表達(dá)，下調(diào)包括核心結(jié)合因子α1或多瘤病毒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白及急性骨髓性白血病因子(Runx2)的肥大標(biāo)志物，與激活核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45相關(guān)因子-2(Nrf2)和Notch信號(hào)通路有關(guān)[7]。淫羊藿苷通過(guò)上調(diào)HES1、Runx2 mRNA表達(dá)及增加Notch1、轉(zhuǎn)錄阻遏物C啟動(dòng)子結(jié)合因子-1(CBF1)、JAG1蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)BMSCs增殖向成骨細(xì)胞分化，其促進(jìn)分化的作用與上調(diào)Notch信號(hào)通路有關(guān)[8]。葛根素誘導(dǎo)BMSCs 2～4周后，測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)和Notch配體之一DLL4含量增加，提示葛根素能有效誘導(dǎo)BMSCs向成骨方向分化，其作用機(jī)制可能與Notch信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不影響B(tài)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，但會(huì)通過(guò)Notch信號(hào)通路的傳導(dǎo)抑制軟骨細(xì)胞的肥大[10]。蟲草素可促進(jìn)BMSCs向軟骨方向分化，同時(shí)下調(diào)Runx2和X型膠原蛋白在內(nèi)的肥大標(biāo)志物，通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/同源結(jié)構(gòu)域蛋白(Bapx1)途徑和Notch信號(hào)傳導(dǎo)抑制軟骨細(xì)胞肥大[11]。補(bǔ)骨脂素能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs內(nèi)已降低的Notch信號(hào)通路活性，提高HES1的表達(dá)水平，促進(jìn)成骨分化，同時(shí)抑制成脂分化和Notch信號(hào)通路活化[12]。周靈通[13]研究表明，使用固本增骨方(藥物組成:炙黃芪、黨參、當(dāng)歸、炙淫羊藿、燙狗脊、鹽補(bǔ)骨脂)含藥血清體外培養(yǎng)BMSCs，可促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化，同時(shí)抑制其向成脂方向分化，固本增骨方含藥血清能夠促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、BGP、Runx2蛋白表達(dá)，這可能與其上調(diào)Notch通路中Notch1 mRNA、下調(diào)Notch通路中CBF1 mRNA有關(guān)。溫智稀等[14]認(rèn)為，鱉甲煎丸能促進(jìn)BMSCs分化為肝樣細(xì)胞，在使用鱉甲煎丸14 d后Notch1 mRNA水平達(dá)到峰值且高于對(duì)照組，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)BMSCs的Notch信號(hào)通路中Notch1蛋白及Notch1 mRNA表達(dá)水平有關(guān)。邢少娜[15]應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合BMSCs治療腦缺血大鼠，觀察大鼠腦缺血預(yù)后，發(fā)現(xiàn)腦缺血部位神經(jīng)損傷癥狀得到明顯改善，其機(jī)制可能與Notch信號(hào)通路中Notch1、HES1、JAG1蛋白表達(dá)水平增高，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖有關(guān)。齊墩果酸主要提取自青葉膽全草或女貞子果實(shí)中的五環(huán)三萜類化合物。研究表明，齊墩果酸及其糖苷可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的形成來(lái)預(yù)防骨質(zhì)流失，并在體外刺激BMSCs的成骨分化，這種作用機(jī)制可能與激活Notch信號(hào)通路有關(guān)[16]。

2.2 中藥抑制Notch通路調(diào)控BMSCs的增殖和分化 黃芪甲苷Ⅳ可誘導(dǎo)快速老化小鼠(SAMR1) BMSCs體外分化為神經(jīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)分化過(guò)程中β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)增高，Notch1蛋白和mRNA的表達(dá)降低，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路、抑制Notch通路有關(guān)[17]。紅景天苷通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路、激活BMP信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs增殖，誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞定向分化[18-19]。謝娟[20]研究表明，益氣活血中藥可以誘導(dǎo)BMSCs向缺血心肌趨化遷移，上調(diào)趨化因子受體4(CXCR4)表達(dá)，同時(shí)下調(diào)HES1 mRNA及HES5 mRNA的表達(dá)，其作用機(jī)制可能為通過(guò)抑制BMSCs的Notch信號(hào)通路來(lái)上調(diào)CXCR4的表達(dá)，從而發(fā)揮促遷移作用。杜紅陽(yáng)等[21]研究認(rèn)為，地黃具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓功效，地黃多糖為地黃的主要成分之一，在誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中抑制了Notch1、JAG1蛋白和NICD蛋白的表達(dá)，Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA水平均下降，地黃多糖可能通過(guò)抑制Notch通路活性從而促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。

3 中藥基于Notch信號(hào)通路對(duì)CSCs的調(diào)控

CSCs可以自我更新、分化，但同時(shí)對(duì)化療和抗癌藥物具有很強(qiáng)的耐藥性，這些特征導(dǎo)致腫瘤治療過(guò)程中容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1表達(dá)水平與CSCs標(biāo)記物乙醛脫氫酶1(ALDH1)顯著相關(guān)，Notch信號(hào)通路可能與CSCs的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)[22]。

槲皮素-3-甲基醚是一種存在于各種植物中的天然化合物，已被證明具有有效的抗癌活性。槲皮素-3-甲基醚能抑制細(xì)胞中球囊形成及干性相關(guān)基因(Sox2)和永生基因(Nanog)的表達(dá)，槲皮素能抑制CSCs生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制人乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，其機(jī)制與抑制Notch1的表達(dá)，誘導(dǎo)PI3K和Akt的磷酸化有關(guān)[23]。楊秦梅等[24]發(fā)現(xiàn)，用姜黃素處理后的肺癌干細(xì)胞凋亡率顯著升高，Notch1和HES1蛋白的表達(dá)明顯下降，說(shuō)明姜黃素能抑制肺癌干細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，機(jī)制可能與下調(diào)Notch信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)。有報(bào)道顯示馬齒莧提取物能夠顯著下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞中Notch1和β-catenin基因的表達(dá)，并呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明其可通過(guò)介導(dǎo)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑和調(diào)節(jié)靶基因發(fā)揮作用[25]。異甘草素是從甘草中分離的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素可抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)并減少腫瘤球的形成，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，并下調(diào)Notch1和HES1 mRNA和蛋白水平，其機(jī)制可能與Notch1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下調(diào)有關(guān)[26]。山姜被證實(shí)可以抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡，免疫印跡分析和熒光素酶測(cè)定顯示，Notch信號(hào)傳導(dǎo)被山姜抑制，可見山姜通過(guò)下調(diào)Notch通路來(lái)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖分化[27]。白藜蘆醇是一種多酚植物抗毒素，具有顯著的藥理特性和調(diào)節(jié)不同癌癥中的多種靶標(biāo)的能力[28]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇顯著激活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)Notch1通路，并呈時(shí)間依賴性恢復(fù)野生型p53表達(dá)，此外白藜蘆醇和Notch1抑制劑MRK-003同時(shí)治療會(huì)部分減弱細(xì)胞凋亡，并完全阻斷Notch1的活化和野生型p53的增加，證實(shí)了白藜蘆醇對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抗增殖和促凋亡作用是通過(guò)上調(diào)Notch1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[29]。

4 中藥基于Notch信號(hào)通路對(duì)NSCs的調(diào)控

NSCs具有干細(xì)胞的特征，在給予誘導(dǎo)劑的條件下，能夠分化為成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。許多中藥對(duì)NSCs的增殖和分化起著綜合調(diào)節(jié)作用[30]。其分化作用受多條信號(hào)通路的調(diào)控，其中Notch通路與NSCs的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

趙克非等[31]研究顯示，健脾益智膠囊(藥物組成：白術(shù)、黃芪、制何首烏、人參、石菖蒲、水蛭)能夠提高大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬HES1 mRNA和蛋白表達(dá)，其促進(jìn)缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化的功能可能與上調(diào)大鼠海馬中Notch1信號(hào)通路有關(guān)。蛇床子素可以促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，減少Notch1的基因表達(dá)量，其機(jī)制可能與蛇床子素抑制Notch信號(hào)通路有關(guān)[32]。還有報(bào)道稱，蛇床子素促進(jìn)NSCs增殖，從而有效挽救了海馬受損小鼠的神經(jīng)元，并改善了認(rèn)知功能障礙，發(fā)生機(jī)制與激活Notch途徑上調(diào)NSCs中自我更新基因Notch1和HES1 mRNA的表達(dá)有關(guān)[33]。六味地黃湯是中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有補(bǔ)腎滋陰、益精填髓功效，研究發(fā)現(xiàn)用六味地黃湯灌胃快速衰老小鼠一段時(shí)間后，能改善其認(rèn)知功能，且小鼠腦組織中Notch1、HES1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)增高，推測(cè)其作用機(jī)制可能與激活Notch1通路、促進(jìn)NSCs增殖、分化有關(guān)[34]。腦泰方(藥物組成：川芎、黃芪、地龍、僵蠶)提取物能促進(jìn)大鼠內(nèi)源性NSCs增殖，提高Notch1蛋白表達(dá)水平，作用機(jī)制可能與激活Notch1信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[35]。劉柏炎等[36]研究表明，齊墩果酸能顯著促進(jìn)胎鼠NSCs增殖，并呈劑量依賴性增加，但達(dá)到一定劑量后有細(xì)胞毒性，增殖過(guò)程中JAG1 mRNA高表達(dá)，由于JAG1為Notch信號(hào)通路的主要配體之一，提示齊墩果酸促進(jìn)NSCs的增殖可能與激活Notch信號(hào)通路有關(guān)[36]。

5 對(duì)其他干細(xì)胞的調(diào)控

丹參酚酸B(Sal B)通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和c-Myc，同時(shí)抑制Notch1、Notch3、JAG2和下游靶基因HES1、HES5來(lái)增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，表明Sal B通過(guò)激活Wnt通路和抑制Notch途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎干細(xì)胞的調(diào)控[37]。有研究表明，扶正化瘀中藥(如丹參、絞股藍(lán)、冬蟲夏草等)似乎可以預(yù)防肝纖維化進(jìn)展，改善肝功能，促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，這一作用機(jī)制是通過(guò)激活Wnt、調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路，抑制Notch途徑來(lái)介導(dǎo)[38]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，苦參堿含藥血清可下調(diào)肝祖細(xì)胞JAG1和HES1 mRNA，上調(diào)肝細(xì)胞標(biāo)記物白蛋白(Alb)的表達(dá)，表明苦參堿可誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。而這種效應(yīng)可被含有0.1 mol/L甲狀旁腺激素(Notch信號(hào)通路激活劑)補(bǔ)充培養(yǎng)基逆轉(zhuǎn)，表明苦參堿可能通過(guò)抑制JAG 1/HES1信號(hào)通路誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞的肝細(xì)胞分化[39]。消痰散結(jié)湯(藥物組成：半夏、天南星、茯苓、枳實(shí)、陳皮、全蝎、蜈蚣、雞內(nèi)金、浙貝母、芥子、甘草)可以抑制胃癌干細(xì)胞增殖，通過(guò)下調(diào)Notch通路的傳導(dǎo)，部分減輕腫瘤血管生成[40]。

6 問題與展望

關(guān)于中藥通過(guò)Notch通路來(lái)調(diào)控干細(xì)胞的研究，國(guó)內(nèi)外不乏相關(guān)報(bào)道，其中有幾個(gè)問題比較突出：①中藥品種多樣，數(shù)量豐富，但被納入研究領(lǐng)域的中藥并不多，缺乏探索精神和創(chuàng)新性；②許多中藥復(fù)方藥物數(shù)目眾多，成分復(fù)雜，單一分析一味湯劑的療效，不能精準(zhǔn)定位具體的有效組分，某種程度上也是資源浪費(fèi)；③被研究的干細(xì)胞種類較為單一，除BMSCs、CSCs、NSCs外，其他類型的干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞等研究甚少；④有些中藥通過(guò)激活Notch通路發(fā)揮作用，而有些中藥則是抑制Notch通路來(lái)調(diào)控干細(xì)胞?？傊兴幨侵嗅t(yī)學(xué)的瑰寶，將中藥與分子生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科聯(lián)系起來(lái)，是把中藥推向現(xiàn)代化的重要手段，也為中藥藥效機(jī)制的闡明提供了有效依據(jù)。