鄭 南 謝 寧 李 全 周妍妍 高麗娟

(黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病是一種內分泌代謝紊亂性疾病，其特征為慢性持續(xù)性的血糖濃度增高、糖耐量異常及尿糖結果陽性，并可伴有脂質代謝異常。根據(jù)糖尿病發(fā)病原因的不同，臨床中又以2型糖尿病為主，且隨著人們飲食結構的改變，2型糖尿病發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1]。近年來大量臨床研究顯示，中醫(yī)藥對于2型糖尿病在控制血糖、改善胰島素抵抗、提高胰島素表達等方面療效確切，且具有毒副作用小、依賴性小的特點[2]。御唐丸是黑龍江中醫(yī)藥大學謝寧教授結合自己多年的臨床經驗研制而成的純中藥復方制劑，臨床研究表明其對2型糖尿病療效確切[3]。為進一步闡述御唐丸的作用機制，我們觀察御糖丸對糖尿病模型大鼠空腹血清胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平及胰腺組織胰島素表達情況的影響，結果如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠150只，體質量180～200 g，周齡8周，采購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(黑)2017-012。

1.2 藥物 御唐丸(主要由黃芪、山茱萸、龜版、烏梅、女貞子、麥冬、山藥、白芍、鹿茸、西洋參、玉竹及葛根組成，由黑龍江省中西醫(yī)結合研究所制劑室負責加工制作)；糖尿樂膠囊(河南輔仁堂制藥有限公司，國藥準字Z10983076)；鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團有限公司，國藥準字H11021518)。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 試劑 大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒、TC測定試劑盒、TG測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；胰島素免疫組化檢測試劑盒(上海一研生物科技有限公司)。

1.3.2 儀器 Infinite F50全自動酶標儀(瑞士Tecan公司)；ZY-1280型全自動生化分析儀(上海科華生物工程股份有限公司)；BX60生物顯微鏡(日本Olympus公司)；紫外分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)；快速血糖儀(德國羅氏公司)；組織包埋機、石蠟切片機(澳大利亞Daintree Scientific公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備 將150只SD大鼠隨機分為空白對照組20只及造模組130只。空白組予基礎飼料喂養(yǎng)。造模組予高脂高糖飲食喂養(yǎng)，并采用STZ腹腔注射法建立2型糖尿病模型[6]，連續(xù)喂養(yǎng)10周，以大鼠空腹腹腔注射血糖(FPG)>16.7 mmol/L且維持1周以上表示造模成功。最后共108只造模成功。

1.4.2 分組及給藥 將造模成功的108只大鼠隨機分為御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組、糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組及模型對照組，每組20只，剩余8只大鼠剔除。御唐丸高、低劑量組分別按2.70、1.35 g/(kg·d)予御唐丸藥液灌胃，糖尿樂膠囊組按0.09 g/(kg·d)予糖尿樂膠囊藥液灌胃，鹽酸二甲雙胍組按2.43 g/(kg·d)予鹽酸二甲雙胍片藥液灌胃，空白對照組及模型對照組分別予2 mL/d蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃8周。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 標本采集 各組大鼠均在末次給藥后禁食水12 h，然后通過摘除眼球取血的方法獲得全血，室溫靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃冷凍保存。取血完畢后采用脫頸法處死大鼠，解剖并摘取胰腺組織，置于4%的多聚甲醛固定液中固定，備用。

1.5.2 FINS檢測及HOMA-IR計算 各組大鼠取血后首先采用快速血糖儀進行FPG檢測，然后均取定量血清，采用ELISA法進行FINS檢測，嚴格按照試劑盒操作說明書進行測定。得到FPG及FINS數(shù)值后再根據(jù)公式計算HOMA-IR。計算公式：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.5.3 TG及TC檢測 各組均取定量血清，采用全自動生化分析儀進行檢測，嚴格按照試劑盒操作說明進行測定。

1.5.4 胰腺組織胰島素表達檢測 采用免疫組化染色法對各組大鼠胰腺組織胰島素表達進行檢測。主要步驟：用石蠟包埋胰腺組織并切片，60 ℃恒溫烤箱中至少烤片1 h，放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇水化，每次2 min；按照一抗的需要，采用抗原修復液對組織切片進行抗原修復處置，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；封閉緩沖液封閉，37 ℃孵育30 min，滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次；封閉緩沖液封閉，37 ℃孵育10 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-SA)(濃度1∶50～200)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5次；使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封固劑封片。最后在顯微鏡下觀察，并采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)[麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]進行分析，棕黃色顆粒為陽性表達，淡藍色背景為陰性表達，陽性目標面積占統(tǒng)計場面積的百分比就是陽性目標面密度，記錄數(shù)值。

2 結 果

2.1 大鼠入組情況 實驗過程中，各組部分大鼠由于高血糖水平、STZ毒性及灌胃不當?shù)仍虺霈F(xiàn)死亡，灌胃8周后共計死亡29只，最終每組各選取順利完成實驗的8只大鼠進行統(tǒng)計分析。

2.2 各組大鼠灌胃后血清FINS及HOMA-IR水平比較 見表1。

組 別nFINS(mmol/L)HOMA-IR空白對照組88.83±1.261.71±0.16模型對照組838.08±2.01?41.02±4.75?糖尿樂膠囊組833.89±2.21△26.46±2.92△鹽酸二甲雙胍組837.82±2.69△20.86±1.98△御唐丸低劑量組834.57±4.93△23.08±3.02△#御唐丸高劑量組829.54±1.82△#□◇21.23±2.72△#

與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05；與鹽酸二甲雙胍組比較,□P<0.05；與御唐丸低劑量組比較，◇P<0.05

由表1可見，與空白對照組比較，模型對照組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯下降(P<0.05)。與糖尿樂膠囊組比較，御唐丸高劑量組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯降低(P<0.05)，御唐丸低劑量組灌胃后HOMA-IR水平明顯降低(P<0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較，御唐丸高劑量組灌胃后FINS水平明顯降低(P<0.05)，HOMA-IR水平與其相當(P>0.05)，御唐丸低劑量組FINS及HOMA-IR水平與其比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與御唐丸低劑量組比較，御唐丸高劑量組灌胃后FINS水平明顯降低(P<0.05)，HOMA-IR水平與其相當(P>0.05)。

2.3 各組大鼠灌胃后血清TC及TG水平比較 見表2。

組 別nTCTG空白對照組81.21±0.090.38±0.05模型對照組82.81±0.60?1.44±0.51?糖尿樂膠囊組82.27±0.31△1.14±0.22△鹽酸二甲雙胍組81.57±0.28△0.65±0.15△御唐丸低劑量組82.26±0.28△□0.85±0.14△#御唐丸高劑量組81.68±0.17△#◇0.67±0.15△#

與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05；與鹽酸二甲雙胍組比較,□P<0.05；與御唐丸低劑量組比較，◇P<0.05

由表2可見，與空白對照組比較，模型對照組灌胃后TC及TG水平均明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平均明顯降低(P<0.05)。與糖尿樂膠囊組比較，御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平均明顯降低(P<0.05)，御唐丸低劑量組灌胃后僅TG水平明顯降低(P<0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較，御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平與鹽酸二甲雙胍組相當(P>0.05)，御唐丸低劑量組TC水平則明顯高于鹽酸二甲雙胍組(P<0.05)。與御唐丸低劑量組比較，御唐丸高劑量組灌胃后TC水平明顯低于御唐丸低劑量組(P<0.05)，TG水平與其相當(P>0.05)。

2.4 各組大鼠灌胃后胰腺組織胰島素表達情況比較 見表3。

組 別n胰腺組織胰島素空白對照組56.260±1.104模型對照組50.570±0.123?糖尿樂膠囊組50.875±0.179鹽酸二甲雙胍組52.224±0.535△御唐丸低劑量組51.589±0.402△御唐丸高劑量組53.003±0.845△#◇

與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05；與御唐丸低劑量組比較，◇P<0.05

由表3可見，與空白對照組比較，模型對照組灌胃后胰腺組織胰島素表達明顯降低(P<0.05)。與模型對照組比較，鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達均明顯升高(P<0.05)，糖尿樂膠囊組表達雖也有升高趨勢，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與糖尿樂膠囊組比較，御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達明顯升高(P<0.05)，御唐丸低劑量組表達雖也有升高，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較，御唐丸高、低劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達水平與其比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與御唐丸低劑量組比較，御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達水平明顯升高(P<0.05)。

2.5 各組大鼠灌胃后胰腺組織胰島素免疫組化觀察情況 空白對照組：胰島細胞邊界清晰，染色顆粒分布濃密均勻。模型對照組：胰島細胞被破壞，染色顆粒分布密度不均。糖尿樂膠囊組:胰島細胞邊界模糊，分布紊亂，染色顆粒微見。鹽酸二甲雙胍組：胰島細胞邊界清晰，染色顆粒分布較少。御唐丸低劑量組:胰島細胞結構趨于完整，染色顆粒相對明顯。御唐丸高劑量組:胰島細胞結構相對完整，染色顆粒明顯。見封3，圖1。

3 討 論

2型糖尿病是一種慢性代謝性疾病，其發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果，與糖尿病家族史、不良飲食習慣、體力活動少、肥胖、酗酒等因素密切相關，同時由于長期高血糖的影響，可導致碳水化合物、脂肪、蛋白質代謝紊亂，大血管、微血管受損，造成多器官的慢性損傷和功能障礙，而導致一系列并發(fā)癥[4-5]。2型糖尿病為進展性的疾病，胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙是其發(fā)病的主要原因，但在其發(fā)生和發(fā)展過程中，究竟是胰島素抵抗先出現(xiàn)，還是胰島素分泌量不足先出現(xiàn)，尚存在一定爭議[6-7]。胰島素抵抗是指一定濃度胰島素對葡萄糖代謝所產生的生物反應偏低、生物學效應減弱的現(xiàn)象。胰島β細胞合成并分泌胰島素主要由血糖濃度的高低決定，但當機體出現(xiàn)胰島素抵抗時，胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，正常水平的胰島素無法激發(fā)誘導肌肉和脂肪細胞吸收葡萄糖的信號,血糖濃度不斷升高，又會對胰島β細胞產生刺激作用，進而促使胰腺代償性合成分泌更大量的胰島素，產生高胰島素血癥以維持血糖的穩(wěn)定，而一旦胰島β細胞受到破壞，在高血糖的情況下無力表達和分泌更多的胰島素，則說明患者正從單純的胰島素抵抗向2型糖尿病轉變[8-9]。脂質代謝紊亂也是2型糖尿病最常見的臨床表現(xiàn)之一，胰島素抵抗或胰島素含量不足均可減弱機體對釋放游離脂肪酸(NEFA)的抑制作用，脂肪組織發(fā)生快速分解，導致大量NEFA被釋放，NEFA通過門靜脈循環(huán)入肝，促進肝臟分泌大量的TC、TG，導致TC、TG水平明顯升高[10]。另外，脂蛋白酯酶是水解TG的關鍵酶，其活性不僅取決于基因的表達，還與胰島素的作用密切相關。2型糖尿病患者由于胰島素水平不足或胰島素抵抗，導致胰島素作用減弱，脂蛋白酯酶活性降低，進而出現(xiàn)TG水平升高[11]。本實驗結果也顯示，模型對照組FINS、HOMA-IR、TC及TG水平較空白對照組均明顯升高(P<0.05)，且胰腺組織中胰島素表達明顯降低(P<0.05)。糖尿樂膠囊和鹽酸二甲雙胍片都是臨床上治療2型糖尿病的常用藥，對2型糖尿病均有確切療效[12-13]，因此我們選為陽性藥物進行對照觀察。本實驗結果也顯示，糖尿樂膠囊和鹽酸二甲雙胍片對糖尿病模型大鼠血清FINS、HOMA-IR、TC、TG均有不同程度的改善。

2型糖尿病屬中醫(yī)學消渴范疇，《內經》中有消渴、消癉、肺消、晶消、消中等10余種病名[14]?！端貑枴て娌≌摗吩唬骸按宋鍤庵缫?，名曰脾癉。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發(fā)也……肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴?！彪m然歷代中醫(yī)學者對2型糖尿病的病因、病機認識各不相同，治療方法也各有側重，但均以健脾補腎為重，認為消渴是以陰虛為本，燥熱為標，真陰虧竭于下，相火妄動于上，水火失濟所致。脾為后天之本，主升清，運化水谷精微，濡養(yǎng)五臟六腑，若氣機升降失常，脾所化生之精微不得上達反而直趨下行，終致陰精自小便而出。腎藏先天之本，主納氣，腎陽充足則氣化、蒸騰作用如常，腎陽不足，津液代謝異常，津液向上輸布無力則口渴欲飲，膀胱失于氣化則小便量多頻數(shù)。御唐丸正是謝寧教授以健脾補腎、益氣養(yǎng)陰為法治療2型糖尿病的經驗方。方中黃芪、西洋參健脾益氣，滋陰補腎，養(yǎng)陰生津；玉竹養(yǎng)陰潤燥，生津止渴；麥冬重滋肺胃，與西洋參合用又走腎水，金水肺腎相濟，止渴生津潤燥；山茱萸補肝益腎，收斂固澀；山藥補中益氣，消渴生津，山藥重補脾之陰精，黃芪重補脾之陽氣，兩藥共用，化漏濁，益脾精，助脾胃運化；葛根升陽止瀉，生津止渴；鹿茸補腎壯陽，補精益髓；烏梅收斂生津，清熱除煩；龜版滋陰潛陽,補腎健骨；女貞子補腎填精；白芍養(yǎng)血調經，斂陰止汗?？v觀全方，配伍精當，共奏健脾補腎、益氣養(yǎng)陰之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪主要含有氨基酸類、微量元素、黃酮類、皂甙、多糖等成分，能夠減少胰島β細胞的凋亡，并促進胰島β細胞合成并分泌胰島素[15]；西洋參的主要活性成分是人參總皂苷，能夠促進胰島組織合成并分泌胰島素，抑制胰島β細胞凋亡，提高機體攝取和消耗葡萄糖的能力，對糖、脂代謝通路產生影響，減少腸道對脂肪及葡萄糖的吸收[16]；女貞子中的齊墩果酸對糖尿病大鼠具有良好的降血糖、降血脂效果，并且齊墩果酸還具有抗自由基損傷的作用,可增強機體的抗氧化能力[17]；玉竹多糖對STZ誘導的糖尿病大鼠血糖有顯著的抑制作用,可增加機體對葡萄糖的攝取，促進肌糖原合成[18]。本實驗結果也顯示，御唐丸高、低劑量組干預后，血清FINS、HOMA-IR、TC、TG水平及胰腺組織胰島素表達情況較模型對照組均有明顯改善(P<0.05)，且御唐丸高劑量組FINS、TC水平及胰腺組織胰島素表達情況改善優(yōu)于御唐丸低劑量組(P<0.05)，且其治療效果優(yōu)于糖尿樂膠囊，基本與鹽酸二甲雙胍片相當，并在降低FINS水平方面優(yōu)于鹽酸二甲雙胍片(P<0.05)。

綜上所述，御唐丸對糖尿病大鼠具有確切療效，可明顯降低大鼠血清FINS水平，，提高胰腺組織的胰島素的表達，減輕胰島素抵抗情況，降低TC及TG水平，改善脂質代謝，且具有一定的量效關系，高劑量水平可能效果更佳。