高晗 鐘蓓

摘要：在過去的十幾年中，染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)（ChIP-seq）成為了分析表觀基因組和鑒定DNA相關(guān)蛋白重要結(jié)合位點的主要技術(shù)。然而，ChIP-seq技術(shù)目前仍存在一些技術(shù)難點。其中一個重要限制是ChIP-seq需要大量的起始材料，需要至少數(shù)百萬個細胞才能啟動，然而實驗中有兩個關(guān)鍵步驟往往會造成所使用的樣本丟失，即染色質(zhì)制備和免疫沉淀。本實驗通過從染色體制備入手，通過選擇兩種不同核酸水解酶DNase和MNase，設計不同實驗組驗證最佳酶切濃度，以優(yōu)化ChIP-seq體系。結(jié)果證明0.1U/μL的MNase為本實驗中ChIP-seq最佳酶切濃度。結(jié)果為ChIP-seq體系的優(yōu)化提供了參考，對ChIP-seq技術(shù)在小鼠早期胚胎細胞中的應用以及發(fā)展有一定的積極意義。

關(guān)鍵詞：小鼠早期胚胎;ChIP-seq;核酸水解酶;酶切效率

中圖分類號：S865.1?文獻標識碼：A文章編號：2095-9737（2020）01-0008-04

Abstract：In the past decade，Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-Seq has become the main technology to analyze epigenome and identify important binding sites of DNA related proteins.However， chip-seq still has some technical difficulties.One important limitation is that chip-seq requires a large amount of starting material，which requires at least millions of cells to start.However， chromatin preparation and immunoprecipitation as two key steps in the experiment usually result in the loss of samples.This experiment started with chromosome preparation，in order to optimize the ChIP-seq system， two different nuclease hydrolases DNase and MNase were selected to design different experimental groups.The results showed that 0.1U/μL MNase was the optimal concentration of ChIP-seq.The results provide a reference for the optimization of ChIP-seq system， and have positive significance for the application and development of chip-seq technology in early mouse embryonic cells.

Key words：Early embryo of mouse; ChIP-seq; Nucleic acid hydrolase; Enzyme digestion efficiency

目前，結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）和下一代測序（Sequencing）的染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)（ChIP-seq）因其能夠真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白的調(diào)控信息，已使許多細胞系和組織類型的全基因組表觀遺傳學分析成為可能，并常使用這一方法研究蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用[1]。

ChIP-seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，使用特異性抗體對DNA結(jié)合蛋白進行免疫沉淀。然后將結(jié)合的DNA共沉淀、純化;隨后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。將獲得的上百萬條序列標簽精確定位到對應的基因組上，然后得到全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。然而ChIP-seq的一個主要限制是需要大量的細胞來生成高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集，需要的細胞數(shù)量往往在百萬級別，而這一實驗的兩個關(guān)鍵步驟往往會造成樣本丟失：染色質(zhì)制備和免疫沉淀。這就排除了使用這一技術(shù)對罕見細胞群的研究。在染色質(zhì)制備上面，可以有超聲和酶切消化兩種方法。由于早期胚胎細胞分裂十分旺盛，染色質(zhì)比較疏松，且含有許多細胞質(zhì)[2]，若使用傳統(tǒng)的超聲方法制備染色質(zhì)，裂解液中會溶解大量的細胞質(zhì)蛋白，對后一步免疫沉淀過程產(chǎn)生影響，且超聲的方法重復性差和具備樣品多的特點不適合早期胚胎細胞量少的情況。

因此，本實驗希望從染色體制備這一實驗環(huán)節(jié)入手，利用核酸水解酶將染色質(zhì)酶切成100～200 bp左右的單核小體片段。而實現(xiàn)這一目標則需要選擇合適種類的基因組水解酶以及摸索出合適的ChIP體系。因而本實驗對使用的基因組水解酶進行種類和離子濃度的篩選，進而對小鼠早期胚胎細胞進行ChIP-seq的體系進行優(yōu)化。

1?核酸水解酶的選擇

本實驗中選用兩種不同的核酸水解酶進行篩選：脫氧核糖核酸酶（DNase）和微球菌核酸酶（MNase）。

DNaseI是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNaseI水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5'端為磷酸基團，3'端為羥基。DNaseI 活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNaseI可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點;二價錳離子存在條件下，DNaseI可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1～2個核苷酸突出的粘末端。

MNase是由金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外核酸內(nèi)切酶，可以較好地分解DNA中富含AT區(qū)域或RNA中富含AU區(qū)域，產(chǎn)物為3'-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。MNase在核酸水解、RNA測序、染色質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究等方面都具有重要意義。

2?材料與方法

2.1?材料

大量小鼠胚胎內(nèi)層細胞團（R1），大量豬胚胎成纖維細胞（PEF），PBS，0.3%BSA，1%甲醛，125 mmol/L甘氨酸（Glycine），核酸提取緩沖液（MNase Master mix），MNase反應混合物，MNase Stop Buffer，Nuclear Breaker Buffer，核酸電泳相關(guān)試劑等。

2.2?方法

2.2.1?設置實驗組

DNaseI：調(diào)整鈣離子濃度和酶濃度，分別設置六組實驗，具體見表1。

MNase：調(diào)整鈣離子濃度和酶濃度，分別設置六組實驗，具體見表2。

2.2.2?DNaseI酶切濃度驗證

（1）消化大量R1細胞后用PBS+0.3%BSA洗2次;

（2）1%的甲醛室溫固定15 min，混旋固定;

（3）用125?mmol/L的甘氨酸（Glycine）解交聯(lián)，室溫混旋5 min;

（4）4℃離心500 g 5 min，用預冷的PBS+0.3%BSA洗2次，棄上清加入20 μL Nuclei Extraction on Buffer和30 μL MNase Master mix，25℃水浴6 min;

（5）加5.5 μL MNase Stop Buffer、5.5 μL Nuclear Breaker Buffer、1 μL PIC和130 μL CHIP Buffer，混勻后吸出10 μL作為Input;

（6）加100 μL CHIP Buffer洗一遍抗體結(jié)合的磁珠，將樣品加入磁珠中4℃過夜;

（7）用預冷的Low Salt Wash Buffer和High Salt Wash Buffer分別洗2次，加入100 μL Hot Elution Buffer，Input中加入90 μL Elution Buffer，樣品放入65℃水浴鍋中水浴1.5～2 h后用DNA片段的回收試劑盒進行回收純化，并跑膠;

（8）隨后使用大量PEF細胞對結(jié)果較好組進行重復驗證。

2.2.3?MNaseI酶切濃度驗證

（1）消化大量R1細胞后用PBS+0.3%BSA洗2次;

（2）1%的甲醛室溫固定15 min，混旋固定;

（3）用125 mmol/L的甘氨酸Glycine解交聯(lián)，室溫混旋5 min;

（4）4℃離心500 g 5 min，用預冷的PBS+0.3%BSA洗2次，棄上清加入20 μl Nuclei Extraction on Buffer和30 μL MNase Master mix，25℃水浴6 min;

（5）加5.5 μL MNase Stop Buffer、5.5 μL Nuclear Breaker Buffer、1 μL PIC和130 μL CHIP Buffer，混勻后吸出10 μL作為Input;

（6）加100 μL CHIP Buffer洗一遍抗體結(jié)合的磁珠，將樣品加入磁珠中4℃過夜;

（7）用預冷的Low Salt Wash Buffer和High Salt Wash Buffer分別洗2次，加入100 μL Hot Elution Buffer，Input中加入90 μL Elution Buffer，樣品放入65℃水浴鍋中水浴1.5～2 h后用DNA片段的回收試劑盒進行回收純化，并跑膠。

3?結(jié)果與分析

3.1?DNaseI酶切濃度驗證

3.1.1?大量R1細胞不同實驗組跑膠圖

由圖1可知，在1～6組的DNaseI酶濃度以及鈣離子濃度下，DNaseI酶切后所獲得片段條帶大多數(shù)大于250 bp。

3.1.2?對1和5組使用大量PEF細胞和R1細胞進行重新驗證

由2圖和圖3可知，在1和5組的DNaseI酶濃度以及鈣離子濃度下，PEF細胞和R1細胞DNaseI酶切后所獲得片段條帶為100～250 bp左右。

3.2?MNase酶切濃度驗證

3.2.1?使用R1細胞進行了MNase酶切濃度的摸索

根據(jù)2.2.1中實驗組的設置，使用R1細胞進行了MNase酶切濃度的摸索。發(fā)現(xiàn)0.1 U/μL即可獲得目標長度的條帶，故選用0.1 U/μL的MNase作為后續(xù)實驗濃度。

3.2.2?進行不同樣本量（1、2、5、10和20個克?。┑腞1細胞0.1 U/μL MNase酶切濃度驗證

1：1個克隆，In1：1組INPUT;2：2個克隆，In2：2組INPUT;5：5個克隆，In5：5組INPUT;10：2個克隆，In10：10組INPUT;20：20個克隆，In20：20組INPUT

由圖4可知，使用0.1 U/μL濃度的MNase進行酶切在五組不同樣本量的（1、2、5、10和20個克?。㏑1細胞實驗組中均可獲得目標長度（100～200 bp左右）的條帶。實驗驗證了使用0.1 U/μLMNase酶切濃度進行酶切在小樣本量中也可獲得目標長度的條帶，達到較理想的實驗效果。

根據(jù)以上實驗結(jié)果選用0.1 U/μL即可獲得高質(zhì)量的目標長度（100～200 bp左右）的條帶。

3.3?分析

使用DNaseI消化小鼠早期胚胎細胞后得到染色質(zhì)片段多大于250 bp，重復驗證后得到的染色質(zhì)片段也在100～250 bp左右，因而通過DNaseI消化小鼠早期胚胎細胞不能保證所獲得的染色質(zhì)均為高質(zhì)量的單核小體，可能存在大于250 bp的雙核小體，對于后續(xù)ChIP-seq實驗效率有一定影響。而選用MNase的消化小鼠早期胚胎細胞后得到染色質(zhì)片段多為100～200 bp左右，其中0.1 U/μL的MNase能得到高質(zhì)量單核小體的目標長度。

因此，本ChIP-seq體系中選用0.1 U/μL的MNase作為后續(xù)實驗的最佳濃度。

4?討論

ChIP-seq技術(shù)可以應用到任何基因組序列已知的物種，通過測序完整揭示免疫沉淀富集的DNA片段包含的蛋白定位信息。近些年來，ChIP-seq技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白修飾的最有力的實驗手段。而基于多種高通量測序平臺的ChIP-seq在基因調(diào)控網(wǎng)絡研究中也發(fā)揮著重要作用。

進行ChIP實驗關(guān)鍵的一個步驟就是染色質(zhì)的制備，根據(jù)小鼠早期胚胎細胞的性質(zhì)，傳統(tǒng)的利用超聲制備染色質(zhì)的方法顯然不可行，因此本實驗通過篩選核酸酶種類以及酶濃度和鈣離子濃度，選擇使用0.1 U/μL微球菌核酸酶（MNase）消化，來制備高質(zhì)量的單核小體染色質(zhì)。

本實驗中對應用于小鼠早期胚胎細胞的ChIP-seq體系中的基因組水解酶的篩選，對早期胚胎細胞的研究產(chǎn)生一定積極意義。以小鼠早期胚胎細胞為材料進行ChIP-seq，可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子或其它表觀遺傳修飾的信息，并可為改良育種提供高效和正確的遺傳信息。實驗中這一體系的獲得，為制備高質(zhì)量的單核小體染色質(zhì)、將ChIP應用于樣本量較少的小鼠早期胚胎細胞中提供了一定參考，減少了早期胚胎細胞樣本量少、分裂活動旺盛、染色質(zhì)較為疏松、含有大量的細胞質(zhì)等特點對ChIP-seq實驗的影響。對現(xiàn)在正在火熱進行的Low Input ChIP-seq的研究有一定積極作用。

參考文獻：

[1] Chen Y W，Negre N，Li Q H，et al. Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity[J].Nat Methods，2012，9（6）：609-614.

[2]?展望，王文，施威揚.長牡蠣中ChIP-seq方法的建立[J].海洋與湖沼，2015，46（6）：1557-1563.