許智 呂逢源 姜二輝 趙小平 尚政軍

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，武漢 430022；

2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，武漢 430030；

3.武漢大學口腔醫(yī)學院口腔基礎醫(yī)學省部共建國家重點實驗培育基地和口腔生物醫(yī)學教育部重點實驗室，武漢 430079

檳榔是一種重要的中藥材，其果實加工后作為一種咀嚼嗜好品被廣泛使用，大部分以咀嚼品的形式推向市場。在很多東亞及東南亞國家，檳榔已經成為僅次于尼古丁、乙醇和咖啡因的第四大嗜好物品。國際癌癥研究中心曾收集并綜合多個國家和地區(qū)的流行病學和分子生物學相關研究，認定檳榔果、檳榔咀嚼塊為一級致癌物。在流行咀嚼檳榔的國家和地區(qū)中，口腔癌（oral cavity cancer）的發(fā)病率居高不下。目前檳榔消耗最大的國家是印度；而中國臺灣地區(qū)亦是咀嚼檳榔嗜好的盛行地[1]。根據中國大陸的相關流行病學研究，在湖南、海南等省份，咀嚼檳榔相當盛行，而隨之帶來的口腔癌發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢[2]，并有向青少年及周邊其他省份蔓延之趨勢[2-3]。此外，咀嚼檳榔與咽癌、喉癌、食道癌等也有明顯相關性[1,4]。

檳榔的主要生物活性成分是所含的生物堿，占其總質量的0.3%～0.6%。其主要包含4種生物堿，分別為檳榔堿（化學名為N-甲基-1,2,5,6-四氫煙酸甲酯）、檳榔次堿、去甲基檳榔堿以及去甲基檳榔次堿[5]。檳榔成分中還有鞣質、甘露醇、脂肪酸等[6]。

有學者[7]曾對咀嚼檳榔誘導口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）癌變患者的病理及臨床生物學行為進行了較大樣本的回顧性研究，結果發(fā)現OSF癌變組患者在臨床及病理學行為上有別于非OSF癌變組，提示OSF病變誘發(fā)的口腔癌患者平均發(fā)病年齡提前。在臨床表現上，OSF發(fā)展而來的口腔癌具有更強的侵襲性和轉移性等腫瘤生物學行為，通常預后較差。有學者[7]認為由咀嚼檳榔導致的OSF可被看作一種“口腔局部的系統(tǒng)疾病”，并形成了一種獨特的疾病“微環(huán)境”。在OSF及OSF癌變發(fā)展過程中檳榔成分可對口腔內不同細胞施以相應作用。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要包括一系列含氧高反應性小分子物質，如氧陰離子、含氧自由基和過氧化氫，通常在細胞內短期存在[8-9]。ROS可以氧化蛋白質、脂質和DNA等，在氧化應激反應中，可作為一種重要的信號分子，相對過量的ROS可以打破細胞內穩(wěn)態(tài)，調控氧化應激反應介導線粒體功能障礙[9]。自噬（autophagy）在諸如饑餓、缺血/再灌注和病原體感染的應激條件下發(fā)生上調，并且可在多種病理狀況中失調，包括癌癥和神經退行性疾病[8,10-11]。鑒于咀嚼檳榔的行為在我國呈進一步增長態(tài)勢，而ROS及自噬在疾病發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[12]，對檳榔與ROS和自噬的關系進行研究總結對OSF及檳榔相關口腔癌這種極具特點的疾病研究應有很好的促進作用。現通過回顧相關文獻對檳榔與ROS及自噬的關系作一綜述。

1 檳榔成分與細胞內ROS關系的相關研究進展

細胞內ROS系統(tǒng)參與構成復雜的細胞內“氧化還原”分子調控網絡，其功能是保持穩(wěn)定的氧化還原環(huán)境[13]。ROS可抑制細胞的活性并促進細胞發(fā)生凋亡；但同時也是很多生理狀態(tài)下多種信號轉導的必要底物，ROS水平的穩(wěn)定是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要條件[14-15]。ROS通過慢性氧化應激反應促進多種病理過程的發(fā)展，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展，已成為腫瘤研究的一個熱點[16-17]。ROS可促進鈣離子從細胞內釋放并激活多個信號轉導途徑，包括鈣調蛋白和蛋白激酶C等，這些重要的信號轉導過程均參與了腫瘤的進展[18]。多種轉錄因子也可被ROS激活。轉錄因子Nrf2可結合Keap1，導致目標蛋白酶體降解；而ROS直接激活蛋白激酶C，促進Nrf2和Keap1的解離，導致Nrf2移位入核。研究[19-21]表明，Keap1基因變異或功能失活可以促進腫瘤的生長和產生化療抵抗。由此可見，ROS信號可與腫瘤的藥物抵抗等相關腫瘤生物學特性存在關聯。ROS被認為與多種頭頸癌的發(fā)病機制和治療過程相關，研究[22]表明，煙草、酒精和檳榔均可通過ROS引起DNA損傷，促進口腔癌變。

研究[23]表明，檳榔提取物（areca nut extract，ANE）可以誘導口腔正常角化上皮細胞內ROS水平上調，同時修飾DNA形成8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG），而8-OHdG參與了多種腫瘤的進程[24-25]。用ANE處理口腔鱗狀細胞癌細胞可顯著增加細胞內ROS水平，刺激絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）上調，增強細胞自噬及凋亡水平[26]。檳榔提取液成分中相對分子質量30～100的部分（簡稱ANE 30-100K）可提高正?？谇火つど掀ぜ毎?、口腔癌和食管癌細胞中ROS水平[27-28]。ANE可以通過ROS途徑刺激口腔成纖維細胞分泌多種細胞因子，這些細胞因子可以對口腔黏膜正常上皮施以作用，促進OSF的發(fā)生發(fā)展。研究[29]發(fā)現，使用ROS清除劑，如NAC等，可以有效降低ROS對細胞的損傷，其具有抑制OSF發(fā)生發(fā)展乃至癌變的潛在作用。ANE除了可以通過ROS介導細胞自噬之外，還可通過ROS途徑參與caspase信號介導的細胞凋亡過程[30-31]。

在對檳榔成分的研究中，檳榔堿具有很高的關注度，其具有明確的化學結構，較早被提純并商品化以便于體內外實驗研究。作為檳榔成分中最主要的生物堿，檳榔堿可誘導斑馬魚胚胎的染色體畸變和發(fā)育遲緩[32-33]。檳榔堿在正?？谇唤腔掀ぜ毎麅日{控與氧化應激反應相關的多個基因，而ROS信號是氧化應激相關反應的重要體現形式[28]。檳榔堿在單獨刺激細胞時可誘導細胞內ROS水平的上升，通過ROS影響下游多個信號，包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapa mycin，mTOR）相關分子信號[31]，mTOR在腫瘤的治療和干預方面發(fā)揮重要的調控作用[34]。研究[31]表明，隨著檳榔堿的濃度增高，mTOR-1的表達呈逐漸降低的趨勢，檳榔堿可通過ROS/mTOR信號通路調節(jié)p21和p27的表達，進而對細胞周期加以調控；提示檳榔堿可以通過ROS途徑導致DNA的損傷，造成DNA復制過程出錯從而促進癌變的發(fā)生，揭示了檳榔堿導致口腔癌變的一種潛在機制。

檳榔成分中除了生物堿，亦富含很多無機金屬元素成分，其中被廣泛關注的便是二價銅離子（Copper-Ⅱ），其在OSF患者口腔黏膜組織及唾液成分中明顯提高[35]。有學者[36]通過研究發(fā)現，Copper-Ⅱ可與檳榔堿產生協(xié)同作用，促進正?？谇火つど掀ぜ毎蠷OS水平上調，ROS的上調促進了口腔上皮萎縮，并認為Copper-Ⅱ和檳榔堿介導的細胞內ROS上調是導致口腔黏膜上皮萎縮以及惡變的關鍵因素。

咀嚼檳榔導致的OSF的臨床和病理改變并不局限于口腔黏膜的角化上皮層[36-38]，針對疾病微環(huán)境的研究是目前的熱點之一，包括OSF的微環(huán)境以及其所導致的口腔癌微環(huán)境的研究。咀嚼檳榔導致的OSF具有一個典型的臨床表現，即張口受限；OSF患者伴有不同程度的張口受限的病理基礎是口腔黏膜上皮下間質細胞發(fā)生相應病理改變：包括纖維結締組織（包括膠原纖維、血管內皮及浸潤的免疫細胞）的病理改變[37]。ROS在疾病微環(huán)境中的作用也逐漸被廣大學者所重視，其與頭頸部癌癥中細胞免疫作用密切相關[39]。研究[40-41]發(fā)現，ANE可通過上調T淋巴細胞內ROS水平抑制T淋巴細胞活化并減少γ干擾素（interferon-γ）的生成、分泌。檳榔成分亦可對外周血淋巴細胞（peripheral blood lymphocytes，PBLs）及白血病來源Jurkat T細胞（Jurkat leukemia T cells）產生類似的作用，上調細胞內ROS水平，即檳榔提取物可以作用于PBLs，導致相關的細胞因子分泌增加，包括炎癥細胞因子（inflammatory cytokines）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）1β以及IL-6和IL-8的表達和分泌上調[42]。ANE 30-100K同樣對Jurkat T細胞以及PBLs產生相應的作用，上調細胞ROS水平并可誘導自噬性凋亡過程，研究結果提示包括T淋巴細胞在內的多種免疫細胞可作為ANE作用的靶細胞[27]。

在OSF病變中，結締組織內微血管的損傷也是其典型的病理表現之一，其直接或間接地導致了張口受限的癥狀[43-44]。研究[45]證明，咀嚼檳榔導致的OSF患者黏膜下血管的密度、血管管徑及微血管密度均有別于正?？谇火つ?，并在不同病變程度的OSF標本中存在差異；從正常黏膜到癌前病變再到癌癥惡變的過程中，血管生成能力不同，提示血管生成能力在檳榔相關口腔癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。在OSF早期血管生成能力增強，而在疾病的晚期血管生成能力減弱，揭示疾病早期相關炎性因子可以促進微環(huán)境中血管生成，而在疾病的中晚期黏膜下表現出的過度纖維化則降低了疾病微環(huán)境中的血管生成能力[44-45]。在對人內皮細胞系的研究中發(fā)現，檳榔堿可改變內皮細胞的細胞周期，促進內皮細胞發(fā)生凋亡并具有明顯的細胞毒性，提示檳榔成分對內皮細胞的損傷作用可能與其相關疾病如OSF、牙周病及心血管疾病密切相關[46-47]。檳榔堿可以刺激人臍靜脈內皮細胞發(fā)生氧化應激反應，促進ROS水平升高；而血紅素氧化酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）可通過ROS途徑表達上調。有趣的是，HO-1可對血管組織產生一定的保護作用[46]，這也在一定程度上解釋了在OSF發(fā)生發(fā)展的早期，成血管能力提高的病理改變。伴隨HO-1的表達升高，細胞黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）/血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表達同樣升高；ROS信號被激活的同時，酪氨酸激酶及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路在人臍靜脈內皮細胞中亦可被檳榔堿激活[48]。

2 檳榔成分與細胞自噬的相關研究進展

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療過程中，自噬表現出了重要的作用，腫瘤細胞的自噬作用可以促進腫瘤發(fā)生凋亡同時又賦予腫瘤細胞抵抗“惡劣環(huán)境”的能力，自噬可被認為是一把“雙刃劍”[11,49-50]。自噬過程可看成是一種細胞對環(huán)境的自我適應能力而不單純是一種凋亡前表現[51]，普遍認為自噬是腫瘤治療過程中的潛在作用靶點[49]。自噬與食道惡性腫瘤及乳腺癌化療過程中的耐藥性有密切相關作用，阻斷腫瘤的自噬過程可以有效提高化療藥物對腫瘤治療的敏感性[33,52]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，自噬和細胞凋亡可由共同的上游信號觸發(fā)，導致細胞自噬和細胞凋亡的聯合發(fā)生，促進了有凋亡缺陷的永生化上皮細胞產生，使其具有致瘤性[33]。研究[33]證實，多種與頭頸部鱗狀細胞癌密切相關的致癌因素可以激活自噬的上游信號。

檳榔成分可以上調細胞自噬水平最先由學者在2008年提出并加以證明，即檳榔成分可使正?？谇簧掀ぜ毎翱谇击[狀細胞癌細胞上調自噬水平[26]；其中ANE 30-100K亦可以有效地誘導正常及惡性上皮細胞發(fā)生自噬[27]。在對人口腔成纖維細胞的研究中，原始檳榔成分以及ANE 30-100K可以通過ROS途徑介導成纖維細胞上調細胞自噬水平[12,48]。在檳榔成分上調細胞自噬的過程中，ROS起到關鍵作用。研究同時表明，檳榔成分尤其是ANE 30-100K，可以在不同細胞系中上調細胞自噬水平，并且影響自噬上游的信號通路和自噬相關腫瘤生物學行為。通過運用化學抑制劑以及shRNA干擾技術，抑制Atg5或Beclin-1可以明顯減弱ANE 30-100K對多種細胞系產生的促自噬作用（包括口腔癌細胞系OECM-1、SCC-15、SCC-25及食管癌上皮細胞系CE81T/VGH和Jurkat T細胞系），證明Atg5及Beclin-1是ANE 30-100K上調自噬水平過程中的關鍵分子。此外，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以作為細胞外調節(jié)激酶的上游信號，調控ANE 30-100K對Jurkat T細胞的自噬作用；阻斷細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路可在Jurkat T/OECM-1/CE81T/VGH細胞中有效降低檳榔所導致的自噬水平[48,53]。

值得一提的是，檳榔成分可對mTOR磷酸化的抑制具有雙向作用，即可以同時調控細胞凋亡和自噬。原始檳榔成分、ANE 30-100K和檳榔堿均可以抑制mTOR的磷酸化，其中原始檳榔成分和ANE 30-100K可通過抑制mTOR磷酸化促進細胞發(fā)生自噬；而單純檳榔堿雖然可以有效抑制細胞內mTOR磷酸化，但并不能通過抑制mTOR磷酸化而進一步上調自噬水平[12]。故而，檳榔堿雖然誘導細胞發(fā)生氧化應激反應，提升細胞內ROS水平而使細胞發(fā)生凋亡，但其不能直接上調細胞自噬水平，檳榔堿需要聯合其他檳榔成分才可有效上調細胞自噬。

高濃度的檳榔提取物對細胞有明顯的毒性作用，為更好地在體外模擬咀嚼檳榔的作用，研究人員選擇運用低毒劑量的ANE長期刺激細胞來設置體外細胞模型[54-56]。在低血清培養(yǎng)的環(huán)境中，長時間低濃度ANE處理的惡性腫瘤細胞可表現出較強的生存能力，提示在惡劣環(huán)境中，檳榔成分上調的細胞自噬水平可能對細胞具有保護作用[52]。采用低濃度ANE刺激口腔鱗狀細胞癌細胞系以及白血病來源的T淋巴細胞系后，發(fā)現腫瘤細胞對常見化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶產生化療抵抗。細胞內 LC3-Ⅱ表達上調證明低毒濃度的檳榔刺激條件下，細胞自噬水平升高；運用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）以及氯喹（chloroquine，CQ）可以有效抑制ANE對腫瘤細胞產生的促自噬作用，并在一定程度上逆轉腫瘤細胞對化療藥物的抵抗作用，提示檳榔成分上調細胞自噬的過程可在腫瘤化療抵抗中發(fā)生作用[56-57]。近期的研究[54]表明，利用ANE對口腔鱗狀細胞癌細胞系進行慢性低毒刺激后，腫瘤細胞對順鉑耐藥性獲得提升且與自噬和ROS水平密切相關，其中AMPK信號通路在其中起關鍵作用。

鑒于自噬在腫瘤治療尤其是化療抵抗中的重要性已被廣泛認可[33,58]，認為在咀嚼檳榔相關的口腔惡性腫瘤中，由于細胞自噬水平上升，腫瘤的生物學特性會有相應改變，尤其是耐藥和耐低氧的能力可能有別于其他原因（如煙酒嗜好、人乳頭瘤感染以及不良義齒機械刺激等）相關的口腔惡性腫瘤。檳榔成分引起自噬和化療耐藥的關系及相關分子機制的研究仍是相關熱點之一，并將對臨床中咀嚼檳榔相關口腔癌治療方案的選擇具有積極的指導作用。

針對腫瘤免疫的研究是近年來癌癥研究的熱點之一，在對口腔鱗狀細胞癌患者組織標本的研究中發(fā)現，自噬相關指標（LC3、Beclin-1以及p62）與腫瘤間質中的免疫相關指標存在明顯關聯，推測口腔鱗狀細胞癌中的自噬水平可與腫瘤微環(huán)境中的免疫作用存在相互作用，但具體機制尚不明確[59]。相關研究的深入探索，可以幫助挖掘檳榔相關口腔癌的腫瘤免疫特點，揭示檳榔相關口腔癌免疫逃逸的機制。

綜上所述，檳榔成分可以有效促進口腔正常細胞（包括口腔角化上皮細胞及間質細胞）以及腫瘤細胞內ROS及自噬水平的增高；檳榔介導的ROS和自噬水平變化可以誘發(fā)細胞的生物學行為發(fā)生相應改變，可與檳榔相關口腔癌的化療耐藥有較強的相關性。針對檳榔成分和細胞內ROS及自噬關系的進一步探究對OSF及咀嚼檳榔相關口腔癌的基礎研究和臨床診治具有積極作用。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。