邱俊杰 王偉舟 趙澤玉 袁勇*

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650033 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PO) 由雌激素缺乏和衰老引起，其特征是低骨密度(bone mineral density, BMD)和骨組織的微結(jié)構(gòu)惡化，并增加了骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險[1]。PO的發(fā)生除了個體的遺傳因素外，也與年齡、飲食、運動量等多方面因素相關(guān)。PO已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計，三分之一的成年女性在其一生中會受到PO及相關(guān)骨折的影響[2]。隨著全球人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥的患病率還將持續(xù)上升，因此更好地闡明PO潛在的發(fā)病機制并尋找有效的抗PO藥物成為目前的研究熱點。

目前的研究表明，PO的發(fā)生與雌激素水平的下降和氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)水平的升高密切相關(guān)。其中，OS是PO最主要的發(fā)病機制之一。人體正常狀態(tài)下的抗氧化機制是完美的，可以通過酶催化和無酶催化消除氧自由基，從而起到抗氧化作用。當(dāng)氧自由基特別是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生增多與抗氧化處理自由基的能力不平衡時，導(dǎo)致OS。OS發(fā)生后可造成對骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的氧化損傷，骨重建失衡，使骨吸收超過骨形成，從而導(dǎo)致PO的發(fā)生[3]。

白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種多酚植物雌激素(反式-3,5,4'-三羥基二苯乙烯)，能夠從紅葡萄、紅葡萄藤、花生和虎杖根等植物中提取[4]。RES具有增強自身免疫力、抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護心血管等多重功效[5]。研究表明RES可以改變骨細(xì)胞的新陳代謝，并具有調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換的能力，是一種天然的抗氧化劑，能有效地防止體內(nèi)由氧化應(yīng)激引起的骨量丟失，從而達(dá)到治療PO的作用[6]。RES亦能夠與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣作用，彌補了雌激素缺乏帶來的骨質(zhì)流失[5]。

1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與氧化應(yīng)激

近年來，盡管在了解雌激素缺乏如何誘導(dǎo)PO方面取得了顯著進展，但PO的發(fā)生并不能完全歸因于雌激素的缺乏。研究發(fā)現(xiàn)僅僅通過補充雌激素并不能完全改善由衰老和疾病導(dǎo)致的各種PO，其潛在的致病機制是復(fù)雜和多方面的[7]。到目前為止，ROS在PO中的作用已被充分證明。在正常生理條件下，ROS在線粒體中不斷產(chǎn)生，但ROS的過量積累將導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以至于最終DNA的損傷[8]。這一系列變化在造成了骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞氧化損傷的同時，刺激破骨細(xì)胞從其前體分化，導(dǎo)致骨吸收增加[9]。也就是說，OS確實參與了骨量的調(diào)節(jié)，并且是PO的罪魁禍?zhǔn)譡10]。

另外，OS也與雌激素的缺乏密切相關(guān)。體外和動物實驗表明，雌激素缺乏增加了ROS的產(chǎn)生并減弱了細(xì)胞的抗氧化防御能力，導(dǎo)致氧化物質(zhì)的積累，而這些氧化物質(zhì)又能夠刺激破骨細(xì)胞形成，增加骨吸收活性[11-12]。因此，雌激素具有通過充當(dāng)抗氧化劑來保護骨骼抵抗OS的能力[13]。

2 白藜蘆醇在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的抗氧化機制

RES作為一種天然的抗氧化劑，可以有效地防止體內(nèi)由OS引起的骨量丟失，從而達(dá)到治療PO的作用。其中涉及的抗氧化機制包括：通過激活SIRT-1促進間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，通過上調(diào)FoxO1抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，通過抑制 p66shc 的磷酸化抑制成骨細(xì)胞凋亡，通過激活Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)促進成骨細(xì)胞增殖。RES還可作用于脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的幾個分子靶標(biāo)，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的減少以及成骨細(xì)胞的增加。接下來將對以上幾個機制展開描述。

2.1 白藜蘆醇通過激活SIRT-1促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是多能細(xì)胞，可以分化成不同類型的結(jié)締組織細(xì)胞(即成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞等)[14]。它們的壽命和功能受到OS的影響。通常增加的ROS可抑制MSC增殖，增加衰老，增強脂肪形成但減少成骨分化。在MSC中，過多的ROS能明顯上調(diào)與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的基因，如 PPARγ2，同時下調(diào)與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因，如 Runx2[15]。已知SIRT1(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶sirtuin的家族成員，被發(fā)現(xiàn)是一種抗衰老基因)通過結(jié)合核受體輔阻遏物(N-CoR)間接地抑制PPARγ2的表達(dá)，以抑制脂肪生成[16]，并通過激活RUNX2依賴性基因轉(zhuǎn)錄促進成骨[15,17]。由OS產(chǎn)生的過量ROS可導(dǎo)致SIRT1蛋白的表達(dá)明顯受抑，進而使RUNX2表達(dá)降低，PPARγ2表達(dá)增加。因此，在ROS過量的情況下，MSC分化偏向于脂肪細(xì)胞[5]。

已知RES是SIRT1的活化劑，通過激活SIRT1，上調(diào)了RUNX2和骨鈣素(OCN)的表達(dá)，同時抑制了脂肪形成中的PPARγ2表達(dá)，從而促進了自發(fā)性骨生成，并阻止了間充質(zhì)祖細(xì)胞的脂肪形成[18]。所以，在OS導(dǎo)致的SIRT1蛋白表達(dá)明顯受抑的情況下，RES以其抗氧化作用激活了SIRT1并促進了MSC的成骨分化，從而發(fā)揮了抗PO的作用。

2.2 白藜蘆醇通過上調(diào)FoxO1抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化

破骨細(xì)胞受各種促破骨細(xì)胞生成以及抗破骨細(xì)胞生成細(xì)胞因子的影響，可分別刺激或抑制其活性[19]。已有研究表明，這些細(xì)胞因子可以直接通過與其位于破骨細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合或經(jīng)由NF-κB(RANK)/RANKL/ OPG系統(tǒng)對破骨細(xì)胞產(chǎn)生影響[20]。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)家族的成員，通過與RANK形成復(fù)合物來觸發(fā)破骨細(xì)胞生成并增加骨質(zhì)流失，是骨量丟失的主要介質(zhì)[21]。OPG作為RANKL的抑制劑，與RANK相結(jié)合以拮抗RANKL的作用，從而抑制骨量丟失[22]。

在更年期，鐵超載及其促發(fā)的OS會引起骨生成的生化標(biāo)志物顯著下降，并通過OPG / RANKL信號傳導(dǎo)途徑增強破骨細(xì)胞生成[5]。動物實驗表明，通過ROS介導(dǎo)的反應(yīng)，鐵可以誘導(dǎo)氧化和抗氧化的不平衡，使Runx2，、OCN和I型膠原蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致小鼠的骨質(zhì)流失。而RES能夠反轉(zhuǎn)過量鐵導(dǎo)致的以上變化，并維持小鼠的抗氧化/促氧化平衡[23]。RES還能夠通過改善OS狀態(tài)增強OPG / RANKL的比例(即OPG的表達(dá)增強與RANKL的表達(dá)降低)，抑制破骨細(xì)胞生成，最終減弱骨吸收并防止體內(nèi)骨量丟失[24]。

在分子水平上，已證實RES抑制PO中破骨細(xì)胞的生成以及對氧化損傷的保護是通過抑制PI3K/ AKT信號通路上調(diào)FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性實現(xiàn)的[25]。在ROS發(fā)生時，細(xì)胞通過上調(diào)抗氧化酶或DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)來保護自身免受ROS的不利影響。該反應(yīng)包括去磷酸化和FoxOs轉(zhuǎn)錄因子的活化[25]。FoxOs轉(zhuǎn)錄因子屬于叉頭框蛋白家族中的一個亞類，它由四個成員組成：FoxO1，F(xiàn)oxO3a，F(xiàn)oxO4和FoxO6，主要參與細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和清除ROS過程[26]。國內(nèi)外多項研究[27]表明，F(xiàn)oxO1可通過激活下游抗氧化基因的表達(dá)同時上調(diào)抗氧化酶(谷胱甘肽過氧化酶和超氧化物歧化酶)的表達(dá)來抵消ROS的產(chǎn)生，發(fā)揮重要的抗OS作用。而FoxO1的活化通常受PI3K/ AKT信號通路的抑制，阻止FoxO1易位進入細(xì)胞核，從而抑制了FoxO1的抗氧化作用。Bartell等[28]闡明M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)和RANKL通過激活A(yù)KT抑制FoxO1轉(zhuǎn)錄降低了過氧化氫酶蛋白的水平,并促進了破骨細(xì)胞中過氧化氫(H2O2)的生成，而H2O2的產(chǎn)生有助于破骨細(xì)胞的形成和骨吸收，以此形成的惡性循環(huán)導(dǎo)致了PO的發(fā)生。動物實驗表明，用RES治療去卵巢大鼠，通過抑制PI3K/ AKT信號通路上調(diào)FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性，F(xiàn)oxO1的轉(zhuǎn)錄被激活，提高了抗氧化酶水平，并抑制破骨細(xì)胞中H2O2的產(chǎn)生，最終抑制破骨細(xì)胞生成。因此，F(xiàn)oxO1可能是RES發(fā)揮抗PO作用的新型有效靶標(biāo)[24]。

2.3 白藜蘆醇通過抑制 p66shc 的磷酸化抑制成骨細(xì)胞凋亡

年齡依賴性骨量減少與ROS水平的逐漸增加、骨中銜接蛋白p66shc的磷酸化有關(guān)[29]，Almeida等[30]的實驗證明了p66shc是H2O2造成成骨細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)。p66shc是一種氧化還原酶，可增加線粒體ROS生成并刺激細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS增加時，p66shc通過在Ser36(絲氨酸36)處的PKCβ(促凋亡信號激活蛋白激酶Cβ)介導(dǎo)下發(fā)生磷酸化而被激活，并將氧化信號轉(zhuǎn)化為凋亡信號。磷酸化的p66shc易位至線粒體，并作為氧化還原酶通過產(chǎn)生H2O2來擴增ROS，增加的H2O2導(dǎo)致細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]。RES可通過抑制 p66shc 的磷酸化，阻止成骨細(xì)胞凋亡，消除了OS對成骨細(xì)胞的不利影響，發(fā)揮抗PO作用[30]。

P66shc磷酸化使ROS產(chǎn)生增多導(dǎo)致的許多后果之一是使以NF-κB為靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄增加[32]。NF-κB是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄因子，在未受刺激的細(xì)胞中，NF-κB因其與內(nèi)源性IκB激酶(IKK)的緊密結(jié)合而被隔離在細(xì)胞質(zhì)中。ROS產(chǎn)生增多使IKK的磷酸化和降解破壞了這種關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致NF-κB活化并允許NF-κB易位到細(xì)胞核中，一方面使成骨細(xì)胞功能受抑，另一方面使RANK與RANKL相互作用促進了破骨細(xì)胞的分化[33]。Wang等[22]的研究證實，RES通過激活I(lǐng)KK表達(dá)，抑制了PO大鼠NF-κB的表達(dá)，使破骨細(xì)胞分化受抑。已發(fā)現(xiàn)雌激素受體(ER)以配體依賴的方式直接抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄。由于ER在成骨細(xì)胞中表達(dá)，在生理條件下雌激素可能負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB的活性。然而，在PO的發(fā)病機制中，由于缺乏雌激素，這種負(fù)調(diào)節(jié)可能會減少，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞中基礎(chǔ)NF-κB活性的升高，繼而使骨形成減少，骨吸收增加，導(dǎo)致了PO的發(fā)生[32-33]。RES以其雌激素樣作用直接抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄，維持骨形成，抑制骨吸收，以此來對抗PO的發(fā)生發(fā)展[5]。

2.4 白藜蘆醇通過激活Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)促進成骨細(xì)胞增殖

研究表明，Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)的激活可促進成骨細(xì)胞增殖[34]。當(dāng)Wnt配體與卷曲受體結(jié)合時，該信號通路即被激活。同時β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并易位到細(xì)胞核中[35]，在那里它與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞生長因子(TCF / LEF)結(jié)合進入復(fù)合體，從而促進多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括那些參與成骨細(xì)胞分化和存活的基因[36]。Wnt信號傳導(dǎo)可以被幾種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)抑制劑下調(diào)。后者包括FoxOs。FoxOs通過與β-catenin結(jié)合并阻止β-catenin與TCF / Lef的結(jié)合而下調(diào)Wnt信號傳導(dǎo)[37]。

在OS狀態(tài)下，成骨細(xì)胞通過FoxOs與β-catenin競爭性結(jié)合，增加自由基清除酶的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮抗氧化作用。其代價是減少了β-catenin與TCF的結(jié)合[38]，使β-catenin / TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變?yōu)镕oxOs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致β-catenin的減少，由此使Wnt信號通路的傳導(dǎo)受到影響，抑制了成骨細(xì)胞的增殖和分化，最終形成了OS誘導(dǎo)的PO[39]。然而Sirt1能使FoxOs發(fā)生脫乙?；瘡亩种艶oxOs與β-catenin的結(jié)合，增加成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖、成骨細(xì)胞的數(shù)量和骨骼的形成[40]。RES通過激活Sirt1，減少FoxOs與β-catenin的結(jié)合，并抑制β-catenin數(shù)量的下降，繼而激活Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)促進成骨細(xì)胞增殖[34]。

3 總結(jié)與展望

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種與衰老有關(guān)的常見病，由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少，結(jié)構(gòu)惡化，骨強度降低，骨折風(fēng)險增加。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一個主要的公共問題，據(jù)估計全球每年有900萬例骨折，因此闡明其潛在的發(fā)病機制，制定有效的預(yù)防策略勢在必行。雌激素缺乏被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的主要原因，但最近的流行病學(xué)證據(jù)和機理研究表明，衰老和相關(guān)的活性氧增加是近端致病因素。氧化應(yīng)激隨著衰老而增加，這與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理生理學(xué)有關(guān)。白藜蘆醇是一種具有抗氧化和抗衰老作用的天然抗氧化劑。它可以通過多種通路抑制氧化應(yīng)激，改變骨細(xì)胞的新陳代謝，并具有調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換的能力，可強烈地防止體內(nèi)由氧化應(yīng)激引起的骨量損失，從而治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。其中涉及的機制包括：激活SIRT-1促進間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，上調(diào)FoxO1抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，抑制 p66shc 磷酸化從而抑制成骨細(xì)胞凋亡，激活Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)促進成骨細(xì)胞增殖。其還可作用于脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的幾個分子靶標(biāo)，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的減少以及成骨細(xì)胞的增加。同時，隨著對于白藜蘆醇在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的研究與進展，白藜蘆醇的有益作用已廣為人知，但其部分作用機制還有待研究，需要我們共同努力，讓白藜蘆醇更好的造福人類。