鄭舒月，彭艷梅，張靜怡，崔慧娟

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院 腫瘤科，北京 102499；3.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，北京 100029）

腫瘤免疫治療主要研究的是免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoints inhibitors，ICIs）的應(yīng) 用[1]，例如 針對(duì)細(xì) 胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）和程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1，PD-1）的單克隆抗體[2，3]。前瞻性試驗(yàn)和薈萃分析已經(jīng)證實(shí)了ICIs 與化療相比在患者中的療效和安全性[4，5]。值得注意的是，一旦ICIs 發(fā)揮作用，它們就更有可能長(zhǎng)期具有抗癌功能，有些人甚至可以完全治愈[6]。然而ICIs 在應(yīng)用于患者機(jī)體治療時(shí)的異質(zhì)性卻很高[7]，能夠從免疫治療中取得顯著療效的患者群體，仍在探索中。人體腸道中有多種微生物，數(shù)目超過(guò)機(jī)體自身細(xì)胞的10 倍。近年研究表明，腸道菌群可以影響腫瘤的免疫治療結(jié)果[8，9]。臨床前的基礎(chǔ)研究提示，腸道微生物群可以通過(guò)與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用調(diào)節(jié)PD-1 抑制劑治療的反應(yīng)[10]。因此，腸道菌群目前被認(rèn)為是一個(gè)可能預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療效果的重要指標(biāo)。

1 腸道菌群對(duì)免疫治療的影響

1.1 相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)研究

2015年Sivan 等[11]注意到一些特殊共生細(xì)菌的豐富度與小鼠模型中PD-1 抑制劑的治療效果相關(guān)。他們比較了相似遺傳基因小鼠 （C57BL/6） 的在不同的腸道微生物群（JAX 和TAC） 中的PD-1 抑制劑治療效果， 結(jié)果表明在JAX 種群中腫瘤生長(zhǎng)較慢，對(duì)PD-1 抑制劑治療更敏感。通過(guò)同居或移植JAX 糞懸液到TAC 小鼠體內(nèi)， 他們發(fā)現(xiàn)這種差異是由于JAX 增強(qiáng)了抗腫瘤的免疫能力。16S rRNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步研究表明，JAX 中的雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）水平升高，最終使得PD-1 抑制劑治療的療效更好。Vétizou 等[12]發(fā)現(xiàn)一些特殊的腸道菌群補(bǔ)充劑可以增強(qiáng)CTLA-4 抑制劑的作用。他們同時(shí)注意到，廣譜抗生素的治療消除了CTLA-4 抑制劑的抗腫瘤作用，而且CTLA-4 抑制劑不能有效地抑制無(wú)菌小鼠的腫瘤進(jìn)展， 這些都表明腸道菌群可能參與了CTLA-4 抑制劑的治療。為了證實(shí)這一結(jié)論，他們又在無(wú)菌小鼠或抗生素治療小鼠中移植了多形擬桿菌、脆弱擬桿菌或伯克霍爾德菌，最終解除了無(wú)菌小鼠對(duì)于CTLA-4 抑制劑的耐藥。

這些基礎(chǔ)研究表明腸道菌群中的部分種群可以提高PD-1 抑制劑和CTLA-4 抑制劑在腫瘤小鼠模型中的療效，甚至解除耐藥，值得在臨床中進(jìn)一步探索研究。

1.2 臨床試驗(yàn)進(jìn)展

Gopalakrishnan 等[13]分析了接受PD-1 抑制劑治療的黑色素瘤患者的腸道微生物群。結(jié)果表明，應(yīng)答者的腸道微生物多樣性較高， 糞便樣本的α-多樣性與無(wú)進(jìn)展生存率（progression-free survival，PFS）呈正相關(guān)。進(jìn)一步細(xì)化分析表明，應(yīng)答者體內(nèi)的大腸桿菌水平較高，而非應(yīng)答者體內(nèi)的大腸埃希菌則顯著富集。Matson 等[14]也注意到腸道菌群對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者PD-1 抑制劑治療效果有影響。他們基于一種綜合的分析方法（包括16S rRNA 測(cè)序、亞基因組鳥槍測(cè)序和物種特異性定量聚合酶鏈反應(yīng)） 觀察到，一些細(xì)菌，如雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜氣性柯林斯菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、乳酸桿菌屬、擬桿菌科和微小埃洛內(nèi)拉菌，在應(yīng)答者中顯著富集，而無(wú)應(yīng)答者中則有大量的卵形瘤胃球菌和腸道羅斯拜瑞氏菌。Routy 等[15]報(bào)道了腸道菌群在PD-1 抑制劑耐藥中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于接受PD-1 抑制劑治療的癌癥患者， 口服抗生素治療 （在PD-1 抑制劑治療開始的前2 個(gè)月或開始后的1 個(gè)月內(nèi)）會(huì)顯著縮短總生存率（overall survival，OS）和PFS。他們進(jìn)一步比較了應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者之間腸道菌群組成上的差異，發(fā)現(xiàn)在應(yīng)答者所有過(guò)度表達(dá)的細(xì)菌中，嗜酸阿克曼菌與患者的應(yīng)答率最顯著相關(guān)（P=0.007）。Chaput 等[16]驗(yàn)證了腸道菌群對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者CTLA-4 抑制劑治療的調(diào)節(jié)作用。在招募的患者中，基線測(cè)量腸道菌群中含有過(guò)多類桿菌的患者預(yù)后不良（P=0.034），而腸道菌群中糞桿菌較多的患者則有長(zhǎng)期的獲益（P=0.0092）。此外，對(duì)存活時(shí)間超過(guò)18 個(gè)月的患者進(jìn)行腸道菌群的分析發(fā)現(xiàn)， 它們含有大量的瘤胃球菌和漆球菌。聚類分析表明，腸道微生物群中含有糞桿菌或其他屬于厚壁菌門類的細(xì)菌的患者往往具有更好的臨床結(jié)果（PFS：P=0.039；OS：P=0.051）。

Jin 等[17]報(bào)道了接受Nivolumab 治療的非小細(xì)胞肺癌患者的數(shù)據(jù)， 通過(guò)16S rRNA 基因測(cè)序分析患者治療前后的糞便標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，腸道菌群多樣性較高的患者比多樣性較低的患者有較長(zhǎng)的PFS。對(duì)Nivolumab 治療的應(yīng)答組和非應(yīng)答組的糞便組成差異性分析表明， 應(yīng)答組的Alistipes putredinis、長(zhǎng)雙歧桿菌和Prevotella copri 等細(xì)菌明顯富集，而非應(yīng)答組的瘤胃球菌則較多。Elkrief 等[18]發(fā)現(xiàn)，在免疫治療前進(jìn)行抗生素治療， 是導(dǎo)致PFS 縮短的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=0.32，95%CI 0.13～0.83）。在免疫治療前接受抗生素治療的患者將會(huì)對(duì)免疫治療的有效反應(yīng)性降低（抗生素組與對(duì)照組的客觀反應(yīng)率分別為0%和34%），預(yù)后改善率下降 （抗生素組對(duì)比對(duì)照組的PFS=0.28，95%CI 0.10～0.76，P=0.01）。

這些研究所發(fā)現(xiàn)的有益腸道菌群的種群雖不完全相同，但可看出桿菌類的細(xì)菌，如雙歧桿菌、大腸桿菌等，往往能夠提高免疫治療的效果。而且大多研究提示在免疫治療的前期使用抗生素會(huì)降低免疫治療的效果。

2 腸道菌群

2.1 腸道菌群的組成和功能

腸道菌群中含有大量的微生物，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、病毒、噬菌體和古細(xì)菌等[19]。一般認(rèn)為腸道菌群由必需菌和機(jī)會(huì)菌組成[20]。必需菌對(duì)人體有益，參與發(fā)酵未消化的碳水化合物和內(nèi)源性粘液，合成短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）和維生素，抵御病原體感染[21，22]。相反，機(jī)會(huì)性細(xì)菌的過(guò)度生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致感染[15]。必需細(xì)菌和機(jī)會(huì)性細(xì)菌之間的不平衡會(huì)導(dǎo)致腸道失調(diào)，這通常是指在環(huán)境或宿主相關(guān)因素的驅(qū)動(dòng)下，微生物群的組成和功能的改變。

腸道的必需菌包括益生菌和共生菌，它們?cè)谀c道能夠形成有重要功能的菌膜。正常情況下，腸道菌群表層的主要成分是大腸埃希菌、腸球菌，中層主要是以類桿菌為主的厭氧菌，深層則主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌。深層的菌群可以與腸黏膜上皮表面的特異性受體結(jié)合，形成可以抵御過(guò)路菌侵襲的生物屏障。雙歧桿菌等益生菌對(duì)機(jī)體的發(fā)育、代謝、合成維生素和微量元素、免疫激活、抵御致病菌、參與腸肝循環(huán)、保護(hù)機(jī)體健康等起到舉足輕重的作用[23]。

2.2 腸道菌群的測(cè)定方法

①分離培養(yǎng)，觀察菌落數(shù)：方萬(wàn)紅[24]在分析四磨湯對(duì)患兒腸道菌群平衡和消化功能的影響時(shí)通過(guò)觀察菌落數(shù)，計(jì)算腸桿菌、葡萄球菌、乳酸桿菌、雙岐桿菌菌落數(shù)作為評(píng)定腸道菌群功能的方法。常規(guī)的基于分離培養(yǎng)、觀察菌落數(shù)的方法雖比較成熟，但是大多腸道菌群不能培養(yǎng)且比較耗時(shí)耗力。因此這種方法不能全面地分析種類和數(shù)量龐大的腸道微生物系統(tǒng)。②質(zhì)譜分析技術(shù)：可以在復(fù)雜體系中同時(shí)區(qū)分不同組分的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量地鑒別不同的腸道菌群。③基因測(cè)序（16S rRNA 設(shè)計(jì)引物）：近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)在細(xì)菌的鑒定與分類研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。Matson 等[15]在研究腸道菌群對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者PD-1抑制劑治療的影響時(shí)采用了綜合的分析方法，其中就包括了16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)。Chaput 等[17]采用16S rRNA 基因測(cè)序來(lái)研究黑色素瘤患者的腸道菌群， 以預(yù)測(cè)ipilimumab 治療療效和結(jié)腸炎的發(fā)生率；Elkrief 等[18]在研究腸道菌群多樣性對(duì)中國(guó)非小細(xì)胞肺癌 （non-small-cell lung cancer，NSCLC） 患者免疫治療療效時(shí)也采用了16S rRNA基因測(cè)序來(lái)評(píng)估大便標(biāo)本中的腸道菌群譜。16S rRNA 基因普遍存在于細(xì)菌細(xì)胞，在細(xì)菌基因組中位于核糖體小亞基（約1540bp），該區(qū)域兼顧保守性和高變性，含有10 個(gè)保守區(qū)域 （Conserved Regions） 和9 個(gè)高變區(qū)域（Variable Regions），保守區(qū)可用于設(shè)計(jì)引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，而通過(guò)對(duì)高變區(qū)的分析可以辨別細(xì)菌種類。因此，16S rRNA基因被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究和物種分類鑒 定[25，26]。

所以當(dāng)粗略估測(cè)腸道菌群部分常見成分的數(shù)量變化多采用觀察菌落數(shù)的方法，而精準(zhǔn)分析腸道菌群成分變化還是需要依賴16S rRNA 設(shè)計(jì)引物的高通量測(cè)序。

3 總結(jié)與討論

目前，免疫治療已逐漸成為腫瘤治療的主流?？鼓[瘤的免疫過(guò)程是用一個(gè)稱為“腫瘤免疫周期”的模型來(lái)描述的。首先由腫瘤源性的抗原啟動(dòng)免疫反應(yīng)，之后抗原提呈細(xì)胞會(huì)捕獲和呈遞腫瘤抗原，接著在外周淋巴器官中的原始T 細(xì)胞就會(huì)被啟動(dòng)和激活。然后，激活的T 細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)、殺死腫瘤細(xì)胞。所以抗腫瘤的免疫療法本質(zhì)上是通過(guò)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細(xì)胞[27]。

而腸道菌群可以調(diào)節(jié)多種免疫效應(yīng)物，尤其是樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）。DC 作為抗原提呈和T 細(xì)胞活化的核心，是免疫監(jiān)視和免疫清除的決定性因素。一些細(xì)菌如雙歧桿菌可以通過(guò)促進(jìn)DC 成熟、 上調(diào)細(xì)胞因子分泌、以及促進(jìn)腫瘤特異性T 細(xì)胞的活化來(lái)增強(qiáng)DC 的功能[24]。所以腸道菌群對(duì)宿主的免疫應(yīng)答有重要的影響，它們可以協(xié)同調(diào)節(jié)腫瘤免疫周期的多個(gè)步驟。目前認(rèn)為在腫瘤的免疫治療中，調(diào)控腸道菌群可以誘導(dǎo)形成系統(tǒng)免疫，進(jìn)而提高療效，克服耐藥性。同時(shí)部分臨床證據(jù)表明，免疫治療前后使用抗生素會(huì)降低免疫治療的效果。

當(dāng)前對(duì)腸道菌群和腫瘤的免疫治療還存在一些問題：①各臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的有益于免疫治療的腸道菌群并不完全相同；②腸道菌群在腫瘤免疫周期中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討；③目前雖然已有不少臨床試驗(yàn)研究腸道菌群對(duì)免疫治療的影響，但是樣本量較小，部分屬于回顧性研究，證據(jù)級(jí)別不高，需要更多前瞻性的研究；④使用抗生素是否影響免疫治療的效果仍存在爭(zhēng)議。所以，期待能夠開展更多的基礎(chǔ)和臨床研究來(lái)探索出有益的腸道菌群，選出免疫治療有效的患者群，進(jìn)而通過(guò)菌群移植等方式提高免疫治療效果，使患者得到更長(zhǎng)的生存期。