王凱，李卓揚，林向進

（浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310003）

肩袖損傷是臨床常見的肩關節(jié)疾病之一，由內(nèi)在和外在因素引起[1]。肩袖損傷如未及時治療，受損肌腱會繼發(fā)變形和萎縮，造成永久性功能障礙。肩袖中肌腱-骨骼的特殊連接結構被稱為“腱骨結構”，此結構從軟腱組織到硬骨骼分為四個過渡梯度[2]：肌腱、非礦化的纖維軟骨、礦化的纖維軟骨和骨骼。四個梯度礦化程度逐漸增加，肌膠原纖維逐漸減少。腱骨結構將機械應變沿著過渡方向分布，以加強肌腱和骨骼之間的結合[3]。肩袖損傷后腱骨結構的修復是通過瘢痕組織形成而不是原有結構再生[4]，新生的瘢痕組織缺乏礦物質分布和膠原纖維組織梯度導致腱骨結構抗張能力變?nèi)酰菀装l(fā)生肌腱二次撕裂[5]。近年來，臨床上對肩袖損傷修復的改進集中在手術和縫合技術上，對腱骨結構再生尚無策略，因此收效不甚理想。然而近期有研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在肩袖損傷的病理刺激下（包括缺氧）可以觸發(fā)外泌體釋放，攜帶再生介質至細胞外基質，保護肌腱基質免受損傷[6]。腱骨愈合是肩袖損傷修復的關鍵，盡管已有研究表明，外泌體在肩袖損傷修復中的積極作用，但目前的研究尚處于早期階段，作用機制仍不明確。本文將綜述外泌體在肩袖損傷領域的研究現(xiàn)狀和進展，發(fā)掘其在肩袖修復中的潛力。

1 外泌體的結構

外泌體（exosomes）是細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一種，Johnstone 等[7]最早于 1983 年在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)，是直徑為30～100nm的多形性囊泡樣小體。較大（直徑＞100nm）的微囊泡一般是細胞膜直接分離而來[8]，外泌體則首先由細胞膜向內(nèi)凹陷形成胞內(nèi)小泡，內(nèi)含部分細胞質，形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體逐漸成熟后選擇性地分揀胞質內(nèi)蛋白質、核酸、脂質等，發(fā)育成晚期內(nèi)體后，其微粒體膜向內(nèi)出芽形成多囊泡內(nèi)體 （multivesicular body，MVB）。MVB形成后一般有兩種結局：與溶酶體膜融合后其內(nèi)容物被水解，以及與細胞膜融合后存在于多囊泡內(nèi)體中的囊泡被釋放到胞外，形成外泌體[9]。

外泌體可由癌癥細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和包括骨骼肌在內(nèi)的多種細胞等釋放[10]，是細胞內(nèi)通訊的高效載體，以自分泌或旁分泌的方式傳遞蛋白質、脂質、miRNA mRNA編碼的信息。產(chǎn)生外泌體的細胞根據(jù)不同激活響應和壓力誘導刺激而產(chǎn)生不同數(shù)量的外泌體，不同組織來源的外泌體釋放其獨特含量的信息來影響細胞外基質環(huán)境[11]。在肌肉骨骼系統(tǒng)，外泌體多由間充質干細胞分泌釋放[12]，攜帶調(diào)節(jié)蛋白的mRNA，即miRNA，被傳遞到各種細胞如成纖維細胞，以改善細胞表型和功能，參與各種生物學過程如免疫反應、細胞增殖、細胞遷移和血管生成[13]。

在體內(nèi)，間充質干細胞可存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血、Wharton’s膠和滑囊液中[14]。 在特殊的微環(huán)境中，間充質干細胞能夠自我更新和分化為多種細胞表型，包括軟骨細胞、肌腱細胞和成骨細胞[15]，其以優(yōu)異的旁分泌、免疫調(diào)節(jié)和血管再生潛力誘導軟組織和硬組織（骨骼）的生長[16]。在肩袖損傷關節(jié)鏡修復手術中，鉚釘放置時可得到骨髓間間充質干細胞[17]，有研究表明，將其應用于肩袖撕裂修復時肌腱功能得到明顯改善[18]。Sevivas等[19]通過將MSCs（其中包含從MSCs釋放的細胞因子、生長因子和外泌體）和肌腱細胞共培育，證實了骨髓來源的MSCs在肩袖肌腱撕裂修復中的作用。體外實驗中表現(xiàn)為肌腱細胞密度和活力增加，體內(nèi)實驗則表現(xiàn)出了更高的肌腱成熟度、斷裂伸長率和較低的硬度，改善了肩袖生物力學和組織學功能。Kim等[20]的研究比較了傳統(tǒng)肩袖損傷修復和注射脂肪來源MSCs修復的患者，在術后12個月的隨訪中，MSCs分泌物治療組的二次撕裂率顯著低于傳統(tǒng)治療組（14.3% VS 28.5%）。這些研究表明，MSCs分泌物可能通過調(diào)節(jié)局部免疫和生物活性環(huán)境使肌腱細胞增殖和分化，提高肌腱愈合程度，改善肩袖修復。

2 外泌體的釋放

人類活檢和動物模型相關實驗證據(jù)表明，缺氧是肩袖肌腱損傷病理學開始和進展的主要誘因。一方面，肌腱組織的血管特性、極端缺氧觸發(fā)凋亡特性會加速肌腱細胞的壞死；另一方面，缺氧激發(fā)了HIF-1α介導的炎癥和修復反應[21]。但同時，缺氧環(huán)境能夠促使MSCs和常駐肌腱干細胞的遷移和增殖，從而促進肌腱愈合[22]，因此MSCs外泌體（MSCs-exos）是聯(lián)系受損組織細胞和周圍MSCs、啟動組織再生的關鍵介質[23]。Hu等[24]進一步證明了低氧下外泌體的釋放，以劑量依賴的方式觸發(fā)了鄰近成纖維細胞群上調(diào)I型膠原蛋白的合成并促進細胞外基質重塑和局部組織修復。由此推斷，肩袖肌腱撕裂造成了局部低氧環(huán)境，誘導了間充質干細胞MSCs的釋放，包含蛋白信息的外泌體至細胞外基質，保護肌腱組織免受損傷并加速組織再生反應。

3 外泌體在肩袖損傷修復中的作用

3.1 對血管生成的作用 外泌體釋放的促血管生成因子包括：促血管生成因子，包括肝素結合性生長因子（HBEGF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白（NT-3）、血小板衍生生長因子（PDGF-ββ）、胎盤生長因子（PLGF）、干細胞因子（SCF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）等，以及血管生長因子，包括粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR2）等[25]。綜合許多研究證明，脂肪來源的MSCs-exos釋放的因子不僅會引起現(xiàn)有血管舒張[26]，還將作用于肩袖損傷修復后組織的血運重建[25]，提供更好的組織灌注，加速傷口愈合最終降低二次撕裂風險。

3.2 對瘢痕形成的作用 瘢痕組織由于膠原纖維的紊亂和錯位，導致新生傷口愈合功能喪失[27]。Wang等[28]分析了小鼠模型中靜脈注射脂肪來源MSCs-exos瘢痕組織愈合的影響，結果顯示，MSCsexos減少了瘢痕面積，增加了Ⅲ型膠原/Ⅰ型膠原的比例，TGF-β3與TGF-β1的比例也提高，這正是膠原形成的重要信號。此外還觀察到基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）和基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）的組織抑制劑水平上調(diào)，從而提高了細胞外基質重塑并抑制了瘢痕組織形成。對MMPs和外泌體的進一步研究發(fā)現(xiàn)，許多外泌體攜帶MMP9，MMP9可促進膠原基質從層狀結構轉向纖維狀結構[29]，同樣證實了外泌體對瘢痕組織形成的影響[30]。

3.3 對炎性反應的作用 人體滑囊液中分離出的外泌體具有骨關節(jié)炎特有的miRNA譜，滑膜成纖維細胞分泌的外泌體被關節(jié)軟骨吸收，并誘導一系列病理變化和分子變化，例如細胞外基質合成基因（ACAN）和Ⅱ型膠原α1（COL2A1）的下調(diào)[31]，基質金屬蛋白酶13（MMP13）和金屬蛋白酶5（ADAMTS-5）的上調(diào)[32]，以及IL-6的產(chǎn)生[31]。有趣的是，與滑囊液中分離出的外泌體相比，MSCs-exos似乎發(fā)揮了相反作用，如通過增加軟骨細胞外基質成分（即Ⅱ型膠原蛋白，軟骨寡聚基質蛋白）的產(chǎn)生來維持軟骨細胞細胞外基質的合成降解平衡[33]，甚至加速軟骨修復[34]。除了維持細胞外基質平衡外，其攜帶的Wnt家族成員5a/5b還激活了Wnt信號轉導通路，靶向下游YAP蛋白途徑，以增強軟骨細胞的增殖和遷移，進而減緩早期骨關節(jié)炎的進展，防止對膝關節(jié)軟骨的嚴重損害[35]。

3.4 對肌肉變性的作用 Bier等[36]研究了胎盤來源的MSCs-exos對 Duchenne肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）患者成肌細胞和小鼠成肌細胞的影響，證明外泌體有助于緩解肌肉變性退化。實驗中發(fā)現(xiàn)，MSCs-exos增加了體外成肌細胞分化，抑制了DMD成肌細胞特征性的纖維蛋白原基因表達，提高了肌肉發(fā)育高水平表達的卵磷脂含量[37]。小鼠肌內(nèi)移植MSCs-exos同樣出現(xiàn)了卵磷脂表達增加，并減少肌酸肝激酶表達，降低心肌和膈肌TGF-β的水平和纖維化，抑制炎癥反應等[36]。

4 作為載體材料的應用

外泌體可以攜帶受體細胞攝取的各種核酸和蛋白質，因此它們是理想的藥物載體。具有毒性或免疫原性的藥物可以封裝在外泌體中靶向運送至目標細胞，以避免全身毒性，如Pascucci等[38]在外泌體中裝載了紫杉醇遞送至耐藥細胞，使細胞毒性增加50倍以上。另有一項研究使用了MSCs-exs裝載的內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）治療缺血性心臟病[39]，在大鼠模型中，該組顯著增加了心肌中EPCs的植入量和存活率，明顯改善了左室舒張末功能。盡管目前尚無 MSCs-exos裝載體治療肌腱撕裂的動物模型或人體相關試驗，但有限的研究給未來治療肩袖損傷降低二次撕裂風險提供了新思路。

5 結論與展望

盡管手術和縫合技術不斷改進，對肩袖損傷修復的認識不斷深入，但其較低的手術成功率和二次撕裂的高風險仍然是臨床上的難題，包括近年來出現(xiàn)的一些修補或支架材料，都難以達到減輕患者疼痛、恢復肌腱功能的要求。外泌體作為細胞外基質的組成成分在促進血管生成、抑制瘢痕組織形成、抑制炎癥免疫反應、減緩肌肉變性退化等過程中扮演著重要角色。但目前外泌體對肩袖損傷愈合作用的研究尚處于早期階段，還需大規(guī)模隊列或前瞻性實驗進一步探索。同時，外泌體展現(xiàn)了作為生物載體材料高循環(huán)穩(wěn)定性、高生物相容性、低免疫原性和低毒性的巨大優(yōu)勢，且其具有大規(guī)模生產(chǎn)和制造的可能性[40]，這些都為提高肩袖肌腱愈合再生提供了研究方向。