許睿真 李洋洋 綜述 丁之德 審校

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2016 級(jí)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)專業(yè)（上海 200025）2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系（上海 200025）

半個(gè)世紀(jì)前，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）是第一個(gè)被表征的蛋白質(zhì)折疊催化劑。它通過(guò)顯示其氧化還原酶和氧化還原調(diào)節(jié)的伴侶活性，在各種生理活動(dòng)中扮演了重要角色。PDI 是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族成員之一，近年來(lái)在神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病、呼吸道炎癥和癌癥等多種疾病的發(fā)病機(jī)制中已被證實(shí)其重要作用。然而，PDI 蛋白家族在生殖領(lǐng)域雖有報(bào)道，但功能及機(jī)制尚不明確，本文將對(duì)PDI 蛋白家族的結(jié)構(gòu)、功能以及在生殖領(lǐng)域中的作用和進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、PDI 家族成員、結(jié)構(gòu)及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的作用

（一）PDI 家族成員

PDI 家族中所有成員都是硫氧還原蛋白（thioredoxin,TRX） 超家族中的一部分，TRX 超家族還包括谷氨酰還原酶(glutaredoxin,Grx)，硫氧還原蛋白等[1]。迄今為止，PDI 家族共由21 個(gè)成員組成，主要成員有PDI（P4HB)、AGR2（PDIA17）、CASQ2（PDIB2）、ERp27（PDIA8）、 PDIA2（PDIp）、ERp57（PDIA3）、TMX1（PDIA11）等,其表達(dá)、定位、大小和功能各不相同。

（二）PDI 家族蛋白結(jié)構(gòu)

作為TRX 超家族成員，PDI 家族的共同結(jié)構(gòu)特征是至少擁有一個(gè)硫氧還原蛋白樣折疊結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，即βαβαβαββα。大多數(shù)PDI 家族成員都包含催化和非催化的硫氧還原蛋白樣結(jié)構(gòu)域，這兩種結(jié)構(gòu)域分別被稱為a 和b 型域，a'、b'則代表結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)中所處的相對(duì)位置[2]。a 和a'結(jié)構(gòu)域在功能上類似于TRX，并且每個(gè)都包含催化的CXXC（Cys-x-x-Cys，CXXC）結(jié)構(gòu)域，具有氧化還原酶活性，其中經(jīng)典的基序則是Cys-Gly-His-Cys。b 和b'結(jié)構(gòu)域沒(méi)有催化活性，其作用似乎是活性區(qū)域間的間隔區(qū)，并通常負(fù)責(zé)底物的募集。另一方面，PDI家族蛋白并非每種都同時(shí)擁有催化基序a 和非催化基序b，如PDI 作為最常見(jiàn)的PDI 家族成員，其結(jié)構(gòu)域組成 為a，b，b' 和a'，擁 有 類 似 結(jié) 構(gòu) 的 成 員 還 有PDIp、ERp57 等，但有些PDI 家族成員僅含催化基序a 而沒(méi)有非催化基序b，如ERp18、ADR2 等，而有些成員則僅有非催化基序，如ERp27。PDI 蛋白質(zhì)家族的另一個(gè)共同特征是存在一個(gè)由Lys-Asp-Glu-Leu-like 序列組成的COOH 末端ER 保留序列[2]，僅有四種PDI 蛋白家族成員不包含該序列。另外，具有a，b，b'，a'結(jié)構(gòu)域成員其b'和a'域之間有一個(gè)較短的域間區(qū)域，稱x 鏈接子。

（三）PDI 家族蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的作用

1.提供形成二硫鍵的環(huán)境

PDI 家族蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也有少量分布于其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是參與蛋白質(zhì)折疊的主要細(xì)胞器，PDI 家族在促進(jìn)蛋白巰基- 二硫鍵轉(zhuǎn)換、二硫鍵形成及重排中均有著重要的作用，并具有分子伴侶的活性。另一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比起細(xì)胞質(zhì)更有利于二硫鍵形成：即擁有更低的還原型谷胱甘肽（GSH）與氧化型谷胱甘肽（GSSG）比例。在細(xì)胞質(zhì)中，谷胱甘肽主要是還原型，而氧化谷胱甘肽的濃度非常低，這種高GSH/GSSG 通過(guò)由與NADPH 偶聯(lián)的谷胱甘肽還原酶組成的穩(wěn)健性還原途徑得以維持，而該系統(tǒng)可抑制二硫鍵形成。另外，與NADPH 偶聯(lián)的TRX 和TRX 還原酶也可以抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白形成二硫鍵[3]。相反，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不含谷胱甘肽還原酶或TRX 還原酶及其同源物，因此GSH:GSSG 的比例較低，即利于二硫鍵形成。

2.在二硫鍵形成中的作用機(jī)制

PDI 蛋白家族可催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白二硫鍵的形成。不同PDI 家族成員的TRX 結(jié)構(gòu)域數(shù)量和位置及其活性部位的化學(xué)性質(zhì)不同。這些成員通過(guò)在二硫鍵形成（氧化反應(yīng)）中充當(dāng)電子受體，或在二硫鍵斷裂（還原反應(yīng)）過(guò)程中充當(dāng)電子供體，催化硫醇- 二硫鍵交換反應(yīng)。PDI 蛋白還通過(guò)催化異構(gòu)化反應(yīng)將非天然二硫鍵重排為天然二硫鍵。特定PDI 蛋白充當(dāng)氧化劑或還原劑的能力取決于CXXC 活性位點(diǎn)的氧化還原電勢(shì)。與胞質(zhì)TRX 的CXPC 基序相比，大多數(shù)PDI 蛋白都含有相對(duì)不穩(wěn)定的活性位點(diǎn)二硫鍵, 而ERdj5 是一個(gè)例外，它包含四個(gè)CXXC 結(jié)構(gòu)域，其中三個(gè)包含CXPC 結(jié)構(gòu)域，在其N 端含有一個(gè)J 結(jié)構(gòu)域。與胞質(zhì)TRX 相似，ERdj5 中的活性位點(diǎn)二硫鍵非常穩(wěn)定，該蛋白是首個(gè)在哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被檢測(cè)出的二硫鍵還原酶。ERdj5 可裂解錯(cuò)誤折疊蛋白的二硫鍵，以促進(jìn)其通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的逆轉(zhuǎn)通道。ERdj5 還可將錯(cuò)誤折疊的底物轉(zhuǎn)移到Ig 結(jié)合蛋白（BiP），BiP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要分子伴侶，它可通過(guò)J 結(jié)構(gòu)域中的HPD（Hys-Pro-Asp）基序與ERdj5 結(jié)合，并將底物募集到逆轉(zhuǎn)通道以促進(jìn)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相關(guān)降解途徑。

PDI 作為伴侶分子具有將二硫鍵引入底物的作用[4]。該分子伴侶作用依賴于PDI 的氧化還原活性。PDI蛋白的a 和a' 域包含規(guī)范的CXXC 活性位點(diǎn)，而CXXC 位點(diǎn)中第一個(gè)半胱氨酸的低pKa (酸度系數(shù))使該殘基參與二硫鍵形成[5]。從結(jié)構(gòu)上看，PDI 的四個(gè)結(jié)構(gòu)域形成U 構(gòu)型，催化結(jié)構(gòu)域a 和a'位于頂部彼此相對(duì)，而結(jié)構(gòu)域b 和b'則處于U 內(nèi)部的催化結(jié)構(gòu)域之間。U 內(nèi)部尤其是b 和b'結(jié)構(gòu)域疏水，并且作為肽和底物錯(cuò)誤折疊區(qū)的主要結(jié)合位點(diǎn)。這種疏水區(qū)域的存在表明PDI 可充當(dāng)伴侶分子，抑制錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集[6]。

3.調(diào)控Ero1 氧化途徑

如前所述，促使二硫鍵形成的PDI 蛋白將被還原，因此必須重新被氧化以進(jìn)行下一次的二硫鍵交換，而該氧化途徑則主要依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1（endoplasmic reticulum oxidase 1,Ero1）。在哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物中存在兩個(gè)Ero1 同源物，即存在于所有組織中的Ero1α 和顯示出某些組織特異性表達(dá)的Ero1β。人體中，Ero1α 通常在所有組織和器官中表達(dá)，而Ero1β 則更多表達(dá)于分泌量較大的細(xì)胞中（如胰腺β 細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞），這種組織分布的差異表明它們可能適用于不同PDI 蛋白，如PDIp 是胰腺β 細(xì)胞的特異性PDI，其只能特異性的被Ero1β 所氧化，進(jìn)而促進(jìn)胰島素蛋白的折疊和生物活性的形成[7]。

Ero1 也是黃素酶，可利用FAD 作為輔因子將電子從PDI 轉(zhuǎn)移到分子氧，從而在過(guò)程中形成過(guò)氧化氫。因此，Ero1 活性過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致高濃度的過(guò)氧化氫產(chǎn)生，從而影響細(xì)胞活力，如人Ero1α 過(guò)表達(dá)會(huì)引起蛋白應(yīng)激反應(yīng)[8]。另一方面，機(jī)體可通過(guò)PDI 及其同源物的反饋調(diào)節(jié)以保持Ero1 活性的穩(wěn)定，并維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氧化還原的平衡[9]，如Ero1 中的調(diào)節(jié)性二硫鍵幫助電子在氧化途徑的轉(zhuǎn)移，PDI 的過(guò)度降低會(huì)導(dǎo)致Ero1α 的調(diào)節(jié)性二硫鍵斷裂來(lái)抑制其活性。相反，一旦形成足夠的氧化型PDI，將促使調(diào)節(jié)性二硫鍵的形成以激活Ero1α 活性[10]。

4.PDI 與Prx4 和GPx7/8 協(xié)同消除和利用H2O2

Ero1-PDI 途徑產(chǎn)生的H2O2可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，因此，體內(nèi)需存在能夠及時(shí)清除多余H2O2的生理活動(dòng)。目前，在人細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中已發(fā)現(xiàn)三種過(guò)氧化物酶可清除過(guò)氧化物，分別為過(guò)氧化物還原酶4（peroxiredoxin 4,Prx4） 和 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶7/8（glutathione peroxidases,GPx7/8）。Prx4 和GPx7/8 可以利用H2O2氧化PDI，并且已有研究顯示多個(gè)PDI 家族成員可直接還原Prx4 和GPx7/8 以回收這三種過(guò)氧化物酶,保證其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的含量。另一方面，PDI 自身也被氧化以便進(jìn)行下一次的二硫鍵交換[11,12]。GPx7 和GPx8 能有效代謝Ero1 生成的H2O2，可能是因?yàn)樗鼈冊(cè)诳臻g上位于PDI-Ero1 復(fù)合物附近[12，13]，而Prx4 主要利用獨(dú)立于Ero1 來(lái)源的H2O2以氧化PDI 家族蛋白[14]。

二、PDI 家族蛋白在生殖領(lǐng)域中的作用

（一）在男性（雄性）生殖中的作用

1993年有研究首次顯示PDI 同工型蛋白在發(fā)育精子的頂體中特定定位，并且指出該蛋白可被轉(zhuǎn)運(yùn)到成熟精子和附睪精子的核中[15]，揭示PDI 家族蛋白在男性生殖過(guò)程中存在潛在作用的可能性。隨后，有研究使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，精子中存在PDI 成員如ERp57，ERp72 及PDIA6 等[16]。

1.ERp57

2006年Ellerman 等證實(shí)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的抑制劑能夠在體外抑制精卵融合，并且ERp57 在配子融合中起關(guān)鍵性作用[17]。2007年Ellerman 等又揭示ERp57 位于人睪丸生精細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及人精子頂體和鞭毛中，該蛋白在精子獲能過(guò)程中被修飾，并再次證實(shí)其在配子間融合中的重要作用[18]。2010年，Wiwanitkit 根據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ERp57 內(nèi)有三個(gè)翻譯后修飾，為明確其缺乏可造成男性不育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[19]。2012年，Zhao 等確認(rèn)ERp57 蛋白存在于大鼠精子發(fā)生和形成的各個(gè)階段細(xì)胞以及Leydig 細(xì)胞中，并且ERp57 mRNA 同樣在幾乎所有大鼠精子發(fā)生階段的細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄，提示其在精子發(fā)生中可能起到的關(guān)鍵性作用[20]。2017年，有關(guān)ERp57 在男性生殖中的研究又有了新的突破，Wong 等證明ERp57 是多聚精子-透明帶受體復(fù)合物（multimeric spermatozoa–zona pellucida receptor complex）的一個(gè)組成部分，可通過(guò)上調(diào)精子表面硫醇含量以調(diào)節(jié)人類精子和透明帶之間的結(jié)合[21]。

2.PDILT

除了普遍存在的PDIA3 外，雄性生殖細(xì)胞還表達(dá)睪丸特異性PDI 樣蛋白PDILT。該蛋白僅存在于減數(shù)分裂后雄性生殖細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，盡管PDILT 沒(méi)有共有的CXXC 結(jié)構(gòu)域，且也不是經(jīng)典的氧化還原酶，但它在體外確實(shí)與鈣鎂蛋白（calmegin,CLGN）和模型蛋白相互作用，這表明它可能在精子蛋白成熟中扮演關(guān)鍵角色，因此其缺失也是男性不育癥的重要因素之一[22]。2012年，Tokuhiro 等研究表明PDILT 與睪丸特異性凝集素伴侶（包括calreticulin-3 和Calegegin）協(xié)同作用，這三種蛋白形成伴侶復(fù)合物，有助于精子生成正確折疊的特異性蛋白，并在ADAM3 的二硫鍵形成中起著不可或缺的作用，而ADAM3 是一種精子膜蛋白，其對(duì)于精子從子宮遷移到輸卵管以及精子與透明帶結(jié)合均至關(guān)重要[23]。PDILT 傾向于結(jié)合蛋白質(zhì)底物中暴露的芳香族殘基，其b' 結(jié)構(gòu)域與鈣網(wǎng)蛋白3(calreticulin-3“CRT3”)P 結(jié)構(gòu)域和Calegein（CMG）之間缺乏相互作用位點(diǎn)，這也提示睪丸特異性凝集素分子伴侶與PDILT 之間存在一種獨(dú)特的相互作用方式[24]。如前所述，PDILT 是雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂后精子發(fā)生的特異性蛋白折疊所必需的分子伴侶，但調(diào)節(jié)該分子伴侶活性的結(jié)構(gòu)機(jī)制并不清楚。2018年，Li 等展示了人全長(zhǎng)PDILT （hPDILT） 的晶體結(jié)構(gòu)和溶液結(jié)構(gòu)，并分析了hPDILT 的分子伴侶活性，由此提供該蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以幫助了解PDILT 分子伴侶活性的確切機(jī)制[25]。

3.PDIA6 和ERp29

2016年，有研究表明PDIA6 和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是熱休克蛋白A2（HSPA2）的相互作用蛋白，并表明該組裝體位于精子頭部頂體周圍區(qū)域的膜筏微區(qū)（membrane raft microdomains）中。由于分子伴侶HSPA2在精子獲能過(guò)程中精子膜表面重塑起關(guān)鍵性作用，并且HSPA2 蛋白表達(dá)不足的人精子缺乏識(shí)別人卵母細(xì)胞的能力。因此，PDIA6/ACE/HSPA2 復(fù)合物可能是參與受精級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵要素。此外，在精子獲能過(guò)程中，ACE 表達(dá)無(wú)明顯變化，而PDIA6 表達(dá)卻顯著增加，并且這種表達(dá)被證明易受氧化應(yīng)激的影響[26]。2019年，有研究發(fā)現(xiàn)使用等滲和低滲溶液活化鱒魚精子時(shí)，精子中PDIA6 的豐度均發(fā)生明顯的變化，并且在等滲溶液中，PDIA6 是所有被檢測(cè)出的精子蛋白中唯一豐度增加的蛋白，而其它在低滲溶液中豐度變化的蛋白在等滲溶液中卻無(wú)明顯的改變,其具體機(jī)制目前還尚未明確[27]。

2007年，ERp29 在大鼠精子中的存在首次被報(bào)道。隨著精子在附睪內(nèi)成熟，精子及其表面和附睪上皮細(xì)胞質(zhì)中ERp29 含量均顯著增加[28]。2010年，研究進(jìn)一步證明了ERp29 在小鼠精子附睪轉(zhuǎn)運(yùn)和頂體反應(yīng)期間的精子上存在顯著性變化。在附睪頭部精子中，ERp29 位于精子頭部的前部區(qū)域，而在附睪尾部則存在于精子的整個(gè)頭部和尾部區(qū)域。此外，ERp29 在頂體反應(yīng)后仍存在于精子頭部的赤道和頂體后區(qū)域，并且證明了ERp29 可能通過(guò)促進(jìn)精卵細(xì)胞膜融合而參與精子受精過(guò)程[29]。

4.PDIA1

PDIA1 是PDI 蛋白家族在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中豐度最高，且介導(dǎo)氧化還原功能的成員，其表達(dá)受三碘甲狀腺素（triiodothyronine，T3） 和雌激素的調(diào)節(jié)。盡管PDIA1 在附睪精子成熟中的作用仍未知，但PDIA1 作為雌激素活性調(diào)節(jié)劑的潛在功能可解釋其在附睪中的表達(dá)作用[30]。2016年，Schorr-Lenz 等證實(shí)，在抗促性腺激素釋放激素（GnRH）免疫后，附睪中PDIA1 和PDIA3 的表達(dá)均發(fā)生了改變，提示附睪中的PDI 表達(dá)受內(nèi)分泌因素影響[31]。2020年，研究發(fā)現(xiàn)PDIA1 存在于年輕種馬的附睪液和精子中，其含量比從24月以下幼馬的附睪液中檢測(cè)到的含量增加了三倍。成年種馬精液中也能檢測(cè)到PDIA1，但其含量與生育力無(wú)關(guān)[32]。此外，由于雌激素的生物合成不僅發(fā)生在睪丸中，也在附睪上皮中繼續(xù)進(jìn)行，因此，PDIA1 在馬附睪液和精子中的存在可能與精子發(fā)生和成熟過(guò)程的雌激素依賴性有關(guān)。

（二）在女性（雌性）生殖中的作用

目前，已有研究報(bào)道部分動(dòng)物的PDI 家族蛋白與女性（雌性）生殖相關(guān)，如2013年有研究顯示PDI 在家豬卵母細(xì)胞中的分布[33]。在鼠類，2011年Rosewell 等研究證明ERp57 和絲氨酸蛋白酶受到基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（MMP2/9）的調(diào)控，而MMP 家族被認(rèn)為在排卵過(guò)程中起重要作用[34]。2014年，Liu 等發(fā)現(xiàn)ERp57 在減數(shù)分裂I（MI）和減數(shù)分裂II（MII）中急劇增加，并可能在精卵融合中扮演了重要的角色[35]。2012年，有研究發(fā)現(xiàn)相比于體內(nèi)成熟的MII 卵母細(xì)胞，體外成熟的MII 卵母細(xì)胞中PDIA6 表達(dá)顯著下調(diào)[36]。2019年Li 等人發(fā)現(xiàn)在體外使用200ng/ml 生長(zhǎng)激素（GH）培養(yǎng)的人卵母細(xì)胞中PDIA6 表達(dá)比對(duì)照組高2.5 倍，因此，PDIA6 在GH組中的高表達(dá)表明GH 的添加可為平衡卵母細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)提供更好的培養(yǎng)環(huán)境[37]。

（三）在胚胎發(fā)育中的作用

迄今為止，雖然PDI 在女性（雌性）生殖中作用的研究較少, 但仍發(fā)現(xiàn)一些與胚胎相關(guān)的研究報(bào)道，如2017年有研究首次鑒定出胎盤中存在PDIA4，并顯示IL-11 可調(diào)節(jié)孕期1-3月的人胎盤絨毛外植體和滋養(yǎng)層細(xì)胞中PDIA4 蛋白水平[38]。2014年又有研究指出，植入前因子（preimplantation factor,PIF）通過(guò)特異性結(jié)合位點(diǎn)與PDI 和熱休克蛋白（HSP）結(jié)合，并在防止胚胎內(nèi)氧化應(yīng)激和功能性蛋白錯(cuò)誤折疊過(guò)程中起關(guān)鍵作用[39]。2017年Goodale 等的研究進(jìn)一步證明PDI 是PIF 在胚胎中的主要靶標(biāo)，PIF 可使其成為重要的ROS 清除劑，并且加入PDI 抑制劑16F16 可顯著減緩胚泡發(fā)育過(guò)程[40]。

三、結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族對(duì)于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊及二硫鍵形成、還原和異構(gòu)等是不可或缺的蛋白，并且對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能以及在不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究意義重大。目前，對(duì)于PDI 家族蛋白在生殖中的研究尚處于初步階段，在女性生殖領(lǐng)域的研究也較為欠缺。因此，在未來(lái)逐漸闡明PDI 家族蛋白在整個(gè)生殖過(guò)程中的作用機(jī)制將有助于為臨床上不孕不育癥等相關(guān)疾病的診斷與治療提供新的思路以及潛在的靶點(diǎn)。