宋振君，李志勇，王永芳，劉 磊，白 輝，董志平

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，國家谷子改良中心，河北省雜糧重點實驗室，河北 石家莊 050035； 2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

WRKY是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一，1994年在甘薯中發(fā)現(xiàn)第一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1，隨后在擬南芥[1]、水稻[2]、大麥[3]、黃瓜[4]、玉米[5]、棉花[6]、番茄[7]和小麥[8]中逐步有很多相關(guān)研究。WRKY家族成員都含有由60個氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，其N端有保守的WRKYGQK序列(WRKY因此得名)，C端包含鋅指結(jié)構(gòu)C2H2或C2HC[9]。

WRKY家族成員廣泛地參與植物的生長發(fā)育與形態(tài)建成[10]。如AtWRKY44(即TTG2)是擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)的與表皮毛和種皮發(fā)育相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子[11]；AtWRKY6在擬南芥衰老的葉片內(nèi)表達量顯著提高，表明其參與葉片的衰老過程[12]。水稻中OsWRKY23的表達主要在根和衰老葉片中，說明其參與根和衰老葉片的表達調(diào)控[13]；OsWRKY13、OsWRKY23、OsWRKY71、OsWRKY12、OsWRKY43、OsWRKY55與OsWRKY86 7個蛋白質(zhì)在苗期表達量較低，隨葉片的生長表達逐步增加，推測它們在葉片的正常生長過程中發(fā)揮作用[14]。

除了在植物正常生長中發(fā)揮作用外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與了植物的抗病過程。OsWRKY22敲除的水稻株系對稻瘟病菌感病，而過表達可增強稻瘟病抗性[15]；OsWRKY71提升了轉(zhuǎn)基因水稻對白葉枯病的抗性[16]；過表達PtrWRKY89增加了楊樹對黑斑病的抗性[17]；TaWRKY70沉默增強了小麥對條銹菌的感病性[18]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過其結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動子區(qū)域的(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)特異性結(jié)合，以調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[19]。如OsWRKY53超表達的轉(zhuǎn)基因水稻中，OsWRKY53特異性地結(jié)合在W盒序列元件上，誘導(dǎo)PBZ1、PR5、PR14、幾丁質(zhì)酶與過氧化物酶等防御相關(guān)基因的表達，提高水稻對稻瘟病的抗性[20]；較未轉(zhuǎn)基因水稻相比，OsWRKY80超表達水稻增強了病程相關(guān)基因ZB8、PBZ1的表達，表現(xiàn)出對稻瘟病較好的抗性[21]；ZmWRKY79過表達的玉米原生質(zhì)體依賴W-box或WLE順式元件，增加了萜類植保素生物合成相關(guān)基因的表達，提高了植株抗生物脅迫能力[22]。上述結(jié)果說明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)防御相關(guān)基因的高水平表達，從而正調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性反應(yīng)。然而，谷子中關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子在抗病反應(yīng)中的相關(guān)研究尚無報道。

谷銹病(Uromycessetariae-italicaeYoshino)是谷子上的重要病害，常年減產(chǎn)10%～30%，流行年份植株倒伏、顆粒無收，嚴重影響著谷子的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)[23]。生產(chǎn)中利用抗銹品種是最經(jīng)濟有效的防治方法。但抗銹品種應(yīng)用中易出現(xiàn)抗性喪失現(xiàn)象，因此，克隆抗銹基因、揭示抗銹機理對快速培育抗銹品種，延長品種使用壽命具有重要意義。WRKY是一類對植物生長發(fā)育、抗病反應(yīng)具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中AtWRKY29/22與水稻中同源基因OsWRKY03都參與了植物的防御反應(yīng)[24-25]，筆者對其在谷子中的同源基因SiWRKY03進行了系統(tǒng)研究，包括利用生物信息學(xué)軟件分析了其生物學(xué)特征，采用Real-time PCR技術(shù)檢測了SiWRKY03轉(zhuǎn)錄因子在谷子不同組織部位和抗谷銹病過程中的表達豐度變化，為探索WRKY成員的功能，了解谷子抗病機理提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗植物材料為谷子抗病材料十里香和感病材料豫谷1號，供試菌株為谷銹菌強毒性小種A57的單孢菌系93-5，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所植保室保存。十里香對谷銹菌單孢菌系93-5的侵染表現(xiàn)抗病反應(yīng)，豫谷1號對93-5的侵染表現(xiàn)感病反應(yīng)。

TRIzol試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)購自賽默飛世爾(中國)科技公司；Real-time PCR使用的TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ購自TaKaRa；引物合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理 谷子發(fā)育過程中的不同組織部位取材：選取谷子品種豫谷1號孕穗期的根、莖、葉、穗4個部位進行樣品采集，錫箔紙包裹置于液氮速凍后，于-80 ℃保存。葉片的谷銹菌接種處理與取材：選取21 d(四-五葉期)長勢一致的十里香和豫谷1號的幼苗，采用新鮮的谷銹菌單孢菌系93-5制備的孢子懸浮液(濃度為1.0×105個/mL)對幼苗進行噴霧接種，分別于接種后0，12，24，36，48，72，96，120 h 8個時間點剪取葉片，錫箔紙包裹置于液氮速凍后，于-80 ℃保存。

1.2.2 谷子SiWRKY03蛋白生物信息學(xué)分析 利用Phytozome植物基因組網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載的谷子豫谷1號參考基因組(Setariaitalicav2.2)，查找SiWRKY03(基因ID：Seita.5G233100)的CDS序列與蛋白質(zhì)序列。利用NCBI的Conserved Domain Database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預(yù)測SiWRKY03蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；利用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對SiWRKY03蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)軟件預(yù)測SiWRKY03蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)；將SiWRKY03蛋白質(zhì)序列在NCBI 中進行Protein Blast比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，按照相似性程度高低選擇來自10個物種的WRKY03的同源基因的蛋白質(zhì)序列，采用Clustal X 2.0進行多重序列比對，利用MEGA 6以鄰近法(Bootstrap設(shè)為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析其親緣關(guān)系的遠近。

1.2.3 谷子中SiWRKY03的實時熒光定量PCR檢測與分析 采用TRIzol試劑提取不同處理條件下取材的谷子樣品的總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，作為Real-time PCR的模板。

根據(jù)SiWRKY03的CDS序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計Real-time PCR引物：SiWRKY03-F(5′-AGAGCCAGCTGAAGAAGGTG-3′)/SiWRKY03-R(5′-CTTCATGCTGCTGCACTTGT-3′)；選用谷子肌動蛋白基因Actin(Seita.8G043100.1)作為內(nèi)參，設(shè)計Real-time PCR引物：Actin-F(5′-CGCATATGTGGCT CTTGACT-3′)/Actin-R(5′-GGGCACCTAAATCTCTCT GC-3′)。Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL ：10 μL TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、0.8 μL上下游引物、2 μL cDNA模板和6.4 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40個循環(huán)收集熒光信號。每個反應(yīng)重復(fù)3次，Ct值取平均值，采用2-ΔΔCt法計算基因在不同樣品中的相對表達量(表達倍數(shù)的閾值設(shè)定為>2，<0.5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiWRKY03蛋白的結(jié)構(gòu)特征

SiWRKY03基因的CDS序列全長為1 137 bp，共編碼378個氨基酸(圖1)。195-251氨基酸序列(WRKYGQK)為WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)序列，是一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能特異性的與目標基因啟動子區(qū)域的(T)(T)TGAC(C/T)序列(Wob)結(jié)合，以調(diào)控基因表達，主要參與植物的抗病防御、衰老和根毛的發(fā)育。

下劃線代表SiWRKY03蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。 The underline represents the conservative domain of SiWRKY03 protein.

2.2 SiWRKY03基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1SiWRKY03基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 利用在線ExPASy-ProtParam tool對SiWRKY03編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為39.73 ku，pI為5.91，平均疏水性系數(shù)為-0.498，屬于親水性蛋白質(zhì)。SiWRKY03基因編碼378個氨基酸，其中丙氨酸(Ala)含量最高(17.7%)，天冬酰胺(Asn)、異亮氨酸(Ile)和色氨酸(Trp)含量最低(分別是1.1%)，帶負電荷氨基酸(天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu))有52個，帶正電荷氨基酸(精氨酸(Arg)+賴氨酸(Lys))46個。

2.2.2 SiWRKY03編碼蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA軟件對SiWRKY03編碼的蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖2-A)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲(Random coil)占52.65%、α-螺旋(Alpha helix)占34.13%、延伸鏈(Extended strand)占6.88%、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)占6.35%。由此可見，SiWRKY03蛋白質(zhì)的最大結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲，最小的元件為β-轉(zhuǎn)角。運用SWISS-MODEL軟件對SiWRKY03蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測與顯示(圖2-B)，并將結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果進行比對，結(jié)果較為一致。

A.二級結(jié)構(gòu)；B.三級結(jié)構(gòu)。 A. Secondary structure; B.Tertiary structure.

2.2.3 SiWRKY03同源性分析 把SiWRKY03編碼的氨基酸序列在NCBI上進行Protein Blast比對，按照序列相似性程度選擇了來自玉米、水稻、小麥、青稞、高粱、糜子、哈氏黍、二穗短柄草、Dichantheliumoligosanthes和大豆中的WRKY03同源基因的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。結(jié)果表明，SiWRKY03與單子葉植物糜子(Panicummiliaceum,RLM93064.1)和哈氏黍(Panicumhallii,PAN29607.1)氨基酸序列的同源性最高(99%)，其次是Dichantheliumoligosanthes(OEL17299.1)，同源性為96%；與雙子葉植物大豆(Glycinemax，XP_003548638.1)同源性最低，僅為28%。

圖3 SiWRKY03的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of SiWRKY03

2.3 SiWRKY03基因的組織表達分析

為了解SiWRKY03基因在谷子不同組織部位中的表達情況，采用Real-time PCR技術(shù)檢測了該基因在谷子豫谷1號孕穗期的根、莖、葉和穗4個部位的表達量。結(jié)果如圖4所示，SiWRKY03在谷子孕穗期的根、莖、葉和穗中均有表達，但主要在根中表達，在其他組織部位中表達水平較低，穗部最低。其中，SiWRKY03在根中的表達量是莖的4.34倍，是葉的3.57倍，是穗的12.50倍。豫谷1號孕穗期根、莖、葉和穗部的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，SiWRKY03在根中的表達量最高，是其他3個部位表達量的5.81，3.80，5.99倍，與Real-time PCR結(jié)果基本一致。

2.4 生物脅迫下SiWRKY03基因的表達分析

采用Real-time PCR檢測分析了SiWRKY03基因在谷子抗病材料十里香和感病材料豫谷1號接種谷銹菌后0，12，24，36，48，72，96，120 h的表達情況。結(jié)果如圖5所示，SiWRKY03在抗病和感病2種反應(yīng)中的表達模式不同?？共》磻?yīng)中，SiWRKY03的表達量在12 h上調(diào)并達到最大表達量，是起始表達量的3.47倍。在36 h同樣上調(diào)表達，表達量為起始表達量的2.16倍，其他時間點SiWRKY03的表達量無顯著變化。在感病反應(yīng)中，SiWRKY03的表達量在所有的時間點均未發(fā)生顯著的變化。推測SiMYB003與抗病相關(guān)，且在抗病反應(yīng)的早期起正調(diào)控作用。

圖4 SiWRKY03在谷子的不同組織部位的表達分析Fig.4 Analysis of expression of SiWRKY03 gene at different tissue of foxtail millet

不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05。 Different lowercase indicate significant different at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

本研究利用Real-time PCR分析SiWRKY03在豫谷1號中不同組織部位的表達情況，結(jié)果顯示，在根、莖、葉和穗中均有表達，在根中表達量最高，推測其參與植株根部的發(fā)育過程。邢國芳等[26]采用生物信息學(xué)方法，對谷子基因組中WRKY家族進行鑒定與分析，得到103個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并對其在不同組織中的表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中80個SiWRKY基因在根中的表達量很高；SiWRKY51和SiWRKY31在葉片中具有高表達量；SiWRKY86和SiWRKY87在莖中高表達；SiWRKY4、SiWRKY6、SiWRKY34、SiWRKY54、SiWRKY57和SiWRKY67在穗中特異性表達，說明WRKY家族基因具有組織表達特性。其中，SiWRKY03基因在根中特異性表達[26]，與本研究結(jié)果一致，猜測SiWRKY03可能在根的生長發(fā)育中起到一定的作用。本試驗結(jié)果對了解WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的功能進一步積累了重要數(shù)據(jù)。

同樣，本研究還分析了SiWRKY03在響應(yīng)谷子抗谷銹菌脅迫反應(yīng)中的表達情況。SiWRKY03在谷子十里香抗銹病反應(yīng)中上調(diào)表達，在豫谷1號感銹病反應(yīng)中表達量無顯著變化，2種表達模式的不同提示基因可能與抗病相關(guān)，且為正調(diào)控因子。在其他物種中已有此基因的同源基因的相關(guān)研究，在水稻中的OsWRKY03超表達會導(dǎo)致OsNPR1以及其他幾種病程相關(guān)基因(如OsPR1b、苯丙氨酸-氨解酶ZB8和過氧化物酶POX22.3)的表達量的提升，表明OsWRKY03對于水稻抗真菌是正調(diào)控因子[25]；OsWRKY03在擬南芥中的同源基因AtWRKY29/22編碼的蛋白，可以被MAP激酶信號級聯(lián)途徑激活，過表達可使植株對細菌和真菌產(chǎn)生抗性[24]。這2個研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致，由此推斷SiWRKY03基因在谷子抗銹病反應(yīng)過程中起正調(diào)控作用，但抗病是一個復(fù)雜的過程，具體的作用機制有待進一步的研究。