羅 云，趙子明

(徐州醫(yī)科大學藥學院，江蘇 徐州 221004)

金納米棒(gold nanorods，GNRs)由于形貌及尺寸可控、溫和的表面化學性質、獨特的表面等離子共振效應等特性，廣泛應用于生物成像、生物傳感、納米材料組裝、載藥等領域[1-4]。通過靜電吸附或巰基共價耦合，GNRs易被葉酸、單抗等修飾，獲得腫瘤靶向性，使其在腫瘤診斷、治療等領域受到廣泛關注[5-8]。

光動力治療是較新的抗腫瘤手段，利用激光激活腫瘤組織內的光敏劑，產生活性氧類破壞細胞核與細胞器，從而殺傷腫瘤[9]。研究發(fā)現(xiàn)，GNRs在激光照射下能產生單線態(tài)氧，且與傳統(tǒng)光敏劑相比，GNRs對酶與光化學降解更耐受[10]。另外，GNRs的表面等離子共振效應波段位于近紅外光區(qū)(800～1 200 nm)，近紅外光在機體組織透過率最高，對人體損害最小。

十六甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)是制備GNRs常用的穩(wěn)定劑，但由于毒性大，限制了該類GNRs的應用[11]。采用聚合物修飾GNRs可以提高其生物相容性。Liao和Hafner[12]制備了巰基化聚乙二醇修飾的GNRs，并利用抗體產生靶向性。Durr等[13]用聚磺苯乙烯鈉和抗表皮生長因子受體單抗修飾CTAB穩(wěn)定的GNRs，制備特異性識別并標記癌細胞的探針。Wei等[14]在GNRs表面修飾溫敏聚合物N-異丙基丙烯酰胺，并裝載鹽酸去甲萬古霉素與無機銀離子。

本研究采用對腫瘤微酸性pH敏感的聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物(polyethylene glycol and 2-piperidinoethylamine co-grafted hyaluronic acid，PPHA)在CTAB穩(wěn)定的GNRs表面形成包衣，以提高其對腫瘤細胞的靶向性，降低毒副作用，使其在抗腫瘤領域發(fā)揮更好的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 透明質酸鈉(分子量：10 000，山東華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司生產，批號：1706086)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(上海麥克林生化科技有限公司生產，批號：C10115871)，N-羥基琥珀酰亞胺(上海麥克林生化科技有限公司生產，批號：M08418025)，1-(2-氨乙基)哌啶(上海阿拉丁試劑有限公司生產，批號：B1925047)，單甲氧基聚乙二醇胺(分子量：5 000，廣州碳水科技有限公司生產，批號：M838268)，四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O，上海展云化工有限公司生產，批號：170912)，CTAB(大連美侖生物技術有限公司生產，批號J1201A)，改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)培養(yǎng)基(江蘇凱基生物科技有限公司生產，批號:AAJ207783)，胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific，批號：42F0863K)，實驗用水為雙蒸水。

激光納米粒度/電位儀(Nicomp 380ZLS,美國PSS公司)，磁力加熱攪拌器(RCT basic，德國IKA公司)，紫外-可見分光光度計(UV-3100PC，上海美普達儀器公司)，透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit Twin，美國FEI公司)，高速離心機(H1850，湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

細胞：小鼠成纖維細胞(L929，中科院上海細胞庫)，人宮頸癌細胞(HeLa細胞，中科院上海細胞庫)。

1.2實驗方法

1.2.1PPHA修飾的GNRs的制備 透明質酸鈉(78 mg)溶解于10 mL 2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液(pH 5.5), 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(192 mg)和N-羥基琥珀酰亞胺(115 mg)；室溫攪拌反應0.5 h后,加入1-(2-氨乙基)哌啶(10 mg)，調節(jié)pH 8.0，攪拌反應2 h；再加入單甲氧基聚乙二醇胺5K (100 mg)繼續(xù)攪拌反應12 h。裝入透析袋(截留分子量為8 000)，透析凍干得PPHA。

參照Ye等[15]的方法制備CTAB保護的GNRs：CTAB(137 mg)溶于4 mL水，加入0.05 mL氯金酸溶液(25 mmol/L)，冰浴下加入0.3 mL的硼氫化鈉溶液(10 mmol/L)，30 ℃放置4 h制成種子溶液。CTAB(1.558 g)溶于42 mL雙蒸水，加入0.72 mL氯金酸溶液(25 mmol/L)和0.27 mL硝酸銀溶液(10 mmol/L)；再加入0.28 mL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L)，攪拌20 s后溶液變成無色，加入0.2 mL種子溶液攪拌60 s，30 ℃靜置過夜。15 000×g離心15 min，棄上清，用水重懸后再次離心去上清，如此重復3次，得GNRs懸液。

將GNRs懸液用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，0.05 mol/L)稀釋為5 mg/mL，按照不同的質量比(0.2∶1，0.6∶1，1∶1，2∶1)加入PPHA溶液，室溫攪拌反應2 h；15 000×g離心15 min，棄上清，再用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸后得PPHA-GNRs混懸液。

1.2.2PPHA修飾的GNRs的表征 PPHA凍干粉溶于氘代二甲基亞砜/氘水混合溶劑(1∶1，體積比)，四甲基硅烷為內標，用核磁共振儀檢測其核磁共振氫譜。

采用納米粒度及zeta電位測定儀(Nicomp 380/ZLS)測定PPHA溶液不同pH下的zeta電位，作圖計算其等電點[16]。將GNRs與PPHA-GNRs配制成2 mg/mL的溶液，納米粒度與zeta電位測定儀測定其粒徑與電位。將GNRs與PPHA-GNRs滴于銅網上自然晾干后，透射電鏡觀察其形態(tài)。采用紫外可見分光光度計對GNRs與PPHA-GNRs的吸收光譜進行掃描(500～800 nm)。

1.2.3PPHA-GNRs的pH敏感性 取PPHA-GNRs混懸液，分別用3種磷酸鹽緩沖液(pH 6.5，7.0，7.4)稀釋至2 mg/mL，納米粒度與zeta電位測定儀測定其粒徑與電位。

1.2.4PPHA-GNRs的體外腫瘤靶向性 取10 mL的GNRs混懸液(5 mg/mL)用稀鹽酸調節(jié)至pH 3，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)修飾的巰基化聚乙二醇(10 mg)，室溫避光攪拌30 min，15 000×g離心15 min，棄上清，再用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸后得FITC標記的GNRs(FITC-GNRs)。將FITC標記的GNRs與適當比例的PPHA混合，室溫避光攪拌反應2 h；15 000×g離心15 min，棄上清，再用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸后得FITC標記的PPHA-GNRs(FITC-PPHA-GNRs)混懸液。

取對數生長期的HeLa細胞置于24孔板培養(yǎng)12 h。棄掉原有培養(yǎng)基，分別更換為pH 6.5的DMEM培養(yǎng)基[采用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸調節(jié)培養(yǎng)基的pH]、pH 7.4的DMEM培養(yǎng)基，然后加入200 μg/mL的FITC-GNRs或FITC-PPHA-GNRs混懸液，放回培養(yǎng)箱共孵育4 h。冷磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌細胞2次，加入RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液裂解細胞20 min；取細胞裂解液用熒光分光光度計檢測GNRs的熒光強度(激發(fā)波長450 nm，發(fā)射波長520 nm，狹縫寬度5 nm)。

取對數生長期的L929細胞與HeLa細胞置于96孔板培養(yǎng)12 h，棄掉原有培養(yǎng)基，分別更換為pH 7.4的DMEM培養(yǎng)基與pH 6.5的DMEM培養(yǎng)基；然后向每孔中加入200 μg/mL的PPHA-GNRs混懸液，放回培養(yǎng)箱共孵育。4 h后，向部分細胞施加1 200 mW/cm2,2 min的近紅外激光(808 nm)照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)20 h。之后加入細胞計數試劑盒-8，共孵育1 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞活力。

2 結 果

2.1PPHA的表征 PPHA的結構式見圖1。透明質酸的特征峰(N-乙酰葡萄糖胺的甲基)出現(xiàn)在1.8 ppm處(a)，1-(2-氨乙基)哌啶基團的特征氫峰出現(xiàn)在2.2 ppm處(b)，聚乙二醇醚鍵特征峰在3.5 ppm附近(c)，見圖2。PPHA的等電點在pH 6.8附近，當pH<6.8時，其電荷發(fā)生由負轉正的突變，見圖3。

PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

2.2PPHA修飾的GNRs的表征 如圖4所示，GNRs為邊緣光滑整齊的棒狀結構，而PPHA-GNRs表面形態(tài)不規(guī)則，這是由于PPHA大分子包衣造成的。隨著PPHA/GNRs質量比的增加，GNRs的尺寸逐漸增大，zeta電位由正值逐漸減少；當PPHA/GNRs質量比為1∶1時，尺寸增大明顯，zeta電位已由正值轉變?yōu)樨撝?，表明PPHA能夠吸附在GNRs表面，并將其原本的正電荷完全掩蓋變?yōu)樨撾姾?。見?。GNRs在500 nm左右有小吸收峰，在780 nm左右有最大吸收峰，PPHA修飾后GNRs的吸收峰未發(fā)生明顯偏移，見圖5。

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

圖4 GNRs(4a)與PPHA-GNRs(4b)的透射電鏡圖

2.3PPHA-GNRs的pH敏感性 PPHA-GNRs具有顯著的pH敏感性：生理pH下，PPHA在GNRs表面形成包衣，電荷為負值；腫瘤微酸性pH下，PPHA因為電荷翻轉(由負電變正電)，與GNRs自身的正電荷相排斥，從GNRs表面脫落，因此PPHA-GNRs的粒徑在pH 6.5時變小，且zeta電位又恢復為正值。見表2。

表1 不同質量比的PPHA-GNRs的粒徑及電勢比較

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

圖5 GNRs與PPHA-GNRs的紫外可見吸收圖譜

表2不同pH條件下PPHA-GNRs的粒徑及電勢比較

pH值粒徑(nm)zeta電位(mV)645.6±5.813.1±2.76.549.3±4.36.4±1.27.056.4±5.2-8.5±1.17.457.3±6.8-9.3±0.7

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物

2.4PPHA-GNRs的體外腫瘤靶向性 FITC標記的GNRs與PPHA-GNRs在腫瘤微酸性pH和生理pH下被HeLa細胞攝取的情況，F(xiàn)ITC-GNRs在pH 6.5和pH 7.4時的細胞攝取量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而FITC-PPHA-GNRs在pH 6.5時的攝取量是pH 7.4時的3.5倍(P<0.05)，見圖6。GNRs在無激光照射條件下對L929細胞和HeLa細胞均有一定的殺傷作用；GNRs在激光照射條件下，對這兩種細胞的毒性均進一步增大。PPHA-GNRs在無激光照射條件下對L929細胞無明顯毒性，而可以造成HeLa細胞30%的殺傷；PPHA-GNRs在激光照射條件下對L929細胞的細胞毒性相比于GNRs有顯著下降(P<0.01)；與自身無激光照射組相比，PPHA-GNRs激光照射組對HeLa細胞的殺傷作用顯著增強(P<0.01)。見圖7。

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物；**與PPHA-GNRs在pH 6.5的攝取量比較，P<0.01

圖6不同pH條件下HeLa細胞對GNRs和PPHA-GNRs的攝取情況

3 討 論

腫瘤細胞的微環(huán)境常呈酸性[17]，鑒于此本研究設計具有pH敏感性的載藥材料，以期解決化療藥物溶解性差、生物利用度低、毒副作用大等缺點。與普通聚合物膠束相比，pH敏感的聚合物膠束到達腫瘤細胞后，在腫瘤細胞偏酸的微環(huán)境中被觸發(fā)，快速釋放藥物，實現(xiàn)藥物的可控釋放[18]。張保磊[19]合成了一種聚合物膠束來包裹光敏劑和化療藥物，依據增強滲透和滯留效應將兩種藥物靶向輸送至黑色素瘤，并由于pH敏感性可較快釋放藥物到達腫瘤組織。鄧亞君[20]合成了一種pH敏感性雙親嵌段共聚物載藥納米膠束，結果證明合成的材料能夠實現(xiàn)pH靶向釋放效應。

7A：L929細胞；7B：HeLa細胞；GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質酸共聚物；**與GNRs 激光照射組比較,P<0.01；##與PPHA-GNRs無激光照射組比較，P<0.01

圖7 GNRs與PPHA-GNRs的殺傷作用

通過聚乙二醇化修飾，納米藥物表面水溶性增加，且可以有效防止免疫系統(tǒng)的追蹤，延長了納米藥物的體內循環(huán)時間，因而近年來成為抗腫瘤藥物改造的研究熱點[21]。Fiorentini等[22]發(fā)現(xiàn)聚乙二醇微球包覆治療不可切除的結腸癌肝轉移對腫瘤反應有效，具有輕微的毒性和良好的質量。多篇文獻報道了關于聚乙二醇作為載體表面修飾材料的應用，他們在研究中合成了脂質體、雙嵌段接枝共聚物、納米膠束等新型藥物給藥系統(tǒng)，結果提示，經聚乙二醇修飾的載藥體系具有不良反應小、體內循環(huán)時間延長等優(yōu)點[23-26]。因此，聚乙二醇作為一種親水高分子材料在抗腫瘤治療、基因治療中具有良好的應用前景。

在生理pH下，PPHA包覆在陽離子GNRs表面并使其表面電荷轉變?yōu)樨撝?，減弱了其與細胞膜的親和力，同時PPHA中的聚乙二醇鏈具有較強的親水性，阻礙了GNRs與細胞膜的相互作用。在腫瘤弱酸性pH下，PPHA可從GNRs表面脫落，內部的陽離子GNRs重新暴露，恢復了其較強的進胞能力。本研究細胞毒性實驗中，對空白對照組施加同樣強度的近紅外激光照射不會對細胞產生明顯殺傷作用，表明單純近紅外激光照射對實驗無干擾。GNRs表面的CTAB陽離子表面活性劑具有細胞毒性, 因此即使無激光照射時GNRs對正常細胞和腫瘤細胞也均有一定的殺傷作用；GNRs在激光照射條件下，對正常細胞和腫瘤細胞的毒性均進一步增大，主要是由于激光照射產生的活性氧類造成的。PPHA-GNRs無論有無激光照射，對正常細胞均無明顯毒性，說明PPHA包衣使GNRs很少被正常細胞攝取，避免了產生后續(xù)的細胞毒性。同時，PPHA-GNRs在腫瘤細胞培養(yǎng)的弱酸性pH條件下脫去PPHA包衣，可以造成腫瘤細胞30%的殺傷；在激光照射條件下對腫瘤細胞的殺傷作用進一步增強，表明脫去包衣的GNRs被HeLa細胞攝取的量較多，經過紅外激光照射后產生足夠的活性氧類，對細胞造成二次殺傷。

綜上所述，本研究成功制備了對腫瘤微環(huán)境pH敏感的PPHA聚合物，并將之與陽離子GNRs結合，形成pH敏感的PPHA包衣的GNRs。與陽離子GNRs相比，PPHA-GNRs對正常細胞的殺傷顯著降低，對腫瘤細胞在近紅外激光的照射下則保持較強的殺傷作用，具有良好的腫瘤靶向性和臨床應用前景。