袁林超，李智濤，詹煜慧，教 楊，高社干，2

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)是慢性牙周炎最主要的致病菌之一[1]，并與許多消化道腫瘤存在相關(guān)性，如口腔癌、食管癌、胰腺癌和胃腸癌等[2]。牙齦卟啉單胞菌可產(chǎn)生多種致病因子，如莢膜、菌毛、牙齦蛋白酶、脂多糖、外膜蛋白等[3]。其中菌毛蛋白主要由fimA基因編碼，根據(jù)基因開放閱讀框架核苷酸序列的差異，fimA基因可分為6型(Ⅰ、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)[4]。

fimA基因具有高度的異質(zhì)性，不同的fimA基因型不僅編碼的菌毛結(jié)構(gòu)特征不同，其生物學(xué)性質(zhì)和毒力特性也存在較大差異[5-6]。多數(shù)的研究表明，fimAⅡ型與Ⅰ型相比具有更強的致病性。fimAⅡ型在牙周炎患者中檢出率最高，被認(rèn)為是高毒力的疾病相關(guān)性菌株；而fimAⅠ型主要分布于牙周健康者中，被認(rèn)為是低毒力的非疾病相關(guān)性菌株[7]。在小鼠模型中，fimAⅡ型菌毛對上皮細(xì)胞的黏附和侵襲能力最強，且Ⅱ型菌毛對上皮細(xì)胞α5β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合能力更大[8]。但也有研究表明不同fimA基因型的細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附和侵襲能力并無差異[9-10]。

本研究擬通過比較牙齦卟啉單胞菌fimA基因型在食管癌患者和牙周健康人群中的分布，觀察在兩組人群中fimA基因檢出率及不同基因型分布是否存在差異，為食管癌的診斷、治療及預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器一次性DNA采集包(深圳華晨陽)，DNA裂解液(亞能生物)，臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀)，恒溫金屬浴(杭州博日)，2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)(南京諾唯贊)，PCR擴增儀(北京百泰克)，水平電泳儀(北京六一)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)，DNA測序儀(美國ABI)。

1.2 研究對象食管癌組：選取2018年9月至12月期間在河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科和腫瘤內(nèi)科住院治療的患者74例，所有患者經(jīng)病理切片確診為食管癌；牙周健康組：選取河南科技大學(xué)在校學(xué)生135例，均身體健康，無系統(tǒng)性疾病，口腔衛(wèi)生狀況良好。所有研究對象均知情同意。

1.3 標(biāo)本的采集及 DNA 的提取

1.3.1 口腔內(nèi)細(xì)菌標(biāo)本的采集使用一次性DNA采集包，采集前先漱口去除口腔內(nèi)的食物殘渣，用采樣拭子在口腔臉頰內(nèi)側(cè)牙齒與牙齦交界處上、下、左、右每處刮拭5次左右，放入含1 mL保存液的采樣管內(nèi)，完成采樣，4 ℃保存。

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA的提取將含口腔拭子的1 mL保存液震蕩混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌EP管中；13 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，沉淀物中加DNA裂解液50 μL，震蕩混勻，至恒溫金屬浴中100 ℃溫浴10 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清(內(nèi)含細(xì)菌基因組DNA)2 μL作為PCR擴增模板。

1.4 PCR 擴增反應(yīng)利用PCR試劑盒對fimA基因進(jìn)行擴增，擴增體系為：2×Mix 12.5 μL、上游引物0.8 μL(5 μM)、下游引物0.8 μL(5 μM)、模板2 μL、雙蒸水補至總體積25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s， 58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s(共35個循環(huán))；72 ℃終延伸10 min。fimA基因各型引物根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)菌株自行設(shè)計，具體序列見表1，各型標(biāo)準(zhǔn)菌株為：Ⅰ型：ATCC33277(D17795.1)；Ⅰb 型：HG1691(AB058848.1)；Ⅱ 型：HW24D1(D17797.1)；Ⅲ 型：6/26(D17801.1)；Ⅳ 型：HG564(D17802.1)；Ⅴ 型： HNA99(AB027294.1)[11]。

表1 牙齦卟啉單胞菌fimA Ⅰ～Ⅴ型和Ⅰb型引物序列

1.5 PCR擴增產(chǎn)物檢測和序列測定將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，統(tǒng)計fimA基因陽性例數(shù)。將fimA基因陽性標(biāo)本送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，采用DNASanger測序技術(shù)，由于6種fimA基因型片段長度在1 132～1 169 bp之間，均>800 bp。采用正、反雙向測序后進(jìn)行拼接得到完整核苷酸序列。

1.6fimA基因分型及同源性分析將測序結(jié)果與fimA各型標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA序列用Clustal X軟件進(jìn)行聚類分析，統(tǒng)計fimA各基因型例數(shù)。通過觀察聚類分析圖譜，并比較各型菌株間DNA序列，對fimA基因同源性進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用例(%)表示，組間的比較用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)P<0.05。

2 結(jié)果

2.1fimA基因擴增結(jié)果經(jīng)PCR擴增fimA基因在74例食管癌患者中陽性52例(70.27%)；135例牙周健康人群中陽性56例(41.48%)。食管癌患者組fimA基因檢出率明顯高于牙周健康組 (P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2fimA基因測序結(jié)果食管癌組fimA基因測序成功49例(3例測序失敗)，牙周健康組fimA基因測序成功53例(3例測序失敗)。測序失敗樣本均為PCR擴增結(jié)果顯示條帶極弱標(biāo)本。

2.3fimA基因分型結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組人群fimA基因各型別之間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.59)。fimA基因型在兩組人群中的分布特征為：均以fimAⅡ型占比最高，其次為Ⅰb型和Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅴ型較低(3種基因型總和占比<15%)。食管癌組和牙周健康組聚類分析結(jié)果見圖1-2。兩組人群fimA各基因型分布情況見表2。

表2 食管癌組和牙周健康組fimA基因基因型分布 例(%)

注：χ2=3.74，P=0.59。

圖1 食管癌組聚類分析結(jié)果

圖2 牙周健康組聚類分析結(jié)果

2.4fimA基因同源性分析fimA基因同源性分布為：fimAⅠ型和Ⅰb 型兩種基因型同源性較近，幾乎處于同一分支；fimAⅡ型在樹狀圖上呈現(xiàn)兩個不同的亞組，且兩組之間同源性相差較大；Ⅲ型、Ⅳ型基因型比較穩(wěn)定。

3 討論

關(guān)于牙齦卟啉單胞菌與食管癌之間的相關(guān)性，高社干等學(xué)者通過一系列相關(guān)研究表明牙齦卟啉單胞菌感染與食管鱗狀細(xì)胞癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)，與患者的預(yù)后和生存率呈負(fù)相關(guān)，并且其相關(guān)抗體能夠作為診斷食管癌的生物學(xué)標(biāo)志物[12-13]。牙齦卟啉單胞菌作為食管癌致病的潛在病原體之一，研究其相關(guān)致病因子與食管癌之間的關(guān)系具有重要意義。

口腔是牙齦卟啉單胞菌最主要的定植部位，與其感染相關(guān)的其他部位的細(xì)菌也大多來源于口腔。唐路等同時對頸動脈粥樣硬化患者斑塊中和齦下菌斑fimA各基因型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)斑塊中fimA各基因型的檢出率與齦下菌斑一致[14]，提示頸動脈粥樣硬化斑塊中的牙齦卟啉單胞菌來源可能與牙周感染相關(guān)。對于食管來說，有研究表明食管菌群與口腔菌群構(gòu)成模式相似[15]，且食管黏膜與口腔黏膜在組織學(xué)上相似，在解剖學(xué)上相連續(xù)，每天吞咽大量唾液可將細(xì)菌帶入食管。因此檢測口腔內(nèi)的牙齦卟啉單胞菌感染對研究食管相關(guān)疾病具有重要價值。

分析牙齦卟啉單胞菌fimA基因及不同分型在食管癌患者和牙周健康人群之間分布是否存在差異，對研究fimA基因在食管癌致病中的作用具有重要價值。本研究結(jié)果中，口腔內(nèi)fimA基因在食管癌患者中陽性率為70.27%，牙周健康人群中陽性率為41.48%，食管癌組檢出率明顯高于牙周健康組(P<0.05)。由于食管癌患者發(fā)病年齡較大，本研究對照人群為大學(xué)生，結(jié)果是否受年齡影響并不清楚，以后將對年齡進(jìn)行匹配做進(jìn)一步研究。

關(guān)于牙齦卟啉單胞菌分布與年齡的相關(guān)性，有研究顯示牙齦卟啉單胞菌檢出率與年齡存在正相關(guān)。也有研究結(jié)果顯示牙齦卟啉單胞菌檢出率在青少年、成人、老年人之間無差異[16]。fimA基因分型結(jié)果顯示，不同基因型在牙周健康人群和食管癌患者之間的分布無明顯差異(P=0.59)，分析原因可能由于本研究檢測標(biāo)本例數(shù)偏少，食管癌組與牙周健康組fimAⅠb(P=0.10)和fimAⅡ(P=0.15)型之間有差異，P值接近0.05，增加標(biāo)本例數(shù)可能會得到有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異。也有可能fimA基因編碼的菌毛作為細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)，其主要功能是參與對組織細(xì)胞的黏附及定植，而牙齦卟啉單胞菌還可以通過其他致病因子誘導(dǎo)致癌物質(zhì)產(chǎn)生或通過改變腫瘤微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17]，而fimA基因只是食管癌發(fā)生的促進(jìn)因素之一。后續(xù)實驗中作者將對不同fimA基因型進(jìn)行克隆、表達(dá)，進(jìn)一步研究其蛋白結(jié)構(gòu)和抗體在食管癌患者中與牙周健康人群相比是否存在差異，探討fimA基因在食管癌患者中的致病機理。

本研究中共有有效測序102例標(biāo)本，結(jié)果均為單基因型。而與以往報道中fimA基因分型存在同一標(biāo)本呈多基因型復(fù)合感染的現(xiàn)象不一致[18-19]。原因可能與檢測方法相關(guān)，其他研究者大都采用PCR擴增，隨后根據(jù)電泳圖譜分型。根據(jù)Nakagawa I的報道：fimAⅠ型、Ⅰb型、Ⅱ型核苷酸序列之間高度同源，Ⅰb 型與Ⅰ型同源性為97.1%，Ⅰb 型與Ⅱ型同源性為77.5%，它們之間極易發(fā)生交叉反應(yīng)[20]。本實驗通過對fimA基因全長測序后進(jìn)行分型，結(jié)果更可信。另外，本實驗中fimAⅡ型同源性分析存在兩個不同的亞組，兩者之間同源性相差較大，處于聚類分析圖譜的不同位置。在Nagano K的研究中fimAⅡ型也呈現(xiàn)兩個亞組，并且Ⅲ、Ⅳ型其組內(nèi)也有亞組出現(xiàn)，但它們之間同源性相差較小[21]。fimAⅡ型存在兩個不同的亞組說明組內(nèi)基因差異較大，但兩個亞組之間的致病性是否也存在差異有待進(jìn)一步研究。

本研究僅對牙齦卟啉單胞菌fimA基因與食管癌的相關(guān)性做了初步的分析，關(guān)于牙齦卟啉單胞菌在食管癌致病中的作用還需更深入的研究。