鄒穎玲，王桂瑛，*，王雪峰，程志斌，谷大海，徐志強，范江平，普岳紅，廖國周，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明650201）

近年來，隨著新興提取技術(shù)的不斷完善和科研技術(shù)的不斷提升，對天然活性肽的研究日漸深入。人類首次發(fā)現(xiàn)具有生物活性的肽類物質(zhì)可以追溯到1902 年，倫敦大學醫(yī)學院科學家Bayliss 和Starting 從動物胃腸中發(fā)現(xiàn)的一種分泌素，具有促進胰腺分泌的作用。通常所說的生物活性肽，是一類具有調(diào)節(jié)機體新陳代謝、參與生命活動調(diào)節(jié)或具有某些特殊作用的肽類物質(zhì)，又稱功能肽。分為內(nèi)源性和外源性生物活性肽，即天然存在活性肽和蛋白酶解活性肽[1]。大多數(shù)已知的生物活性肽通常含有2～20 個氨基酸殘基，這些殘基與特定序列連接，在特殊情況下，這個范圍可以擴大[2]。生物活性肽的活性取決于其結(jié)構(gòu)，如氨基酸組成、N 端和C 端氨基酸類型、肽鏈的重量和長度、氨基酸的電荷特性、疏水、親水特性、空間結(jié)構(gòu)等。例如，具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性的肽通常在N-末端含有芳香族或堿性氨基酸，在C-末端含有較多的疏水性和正電荷氨基酸[3]。然而，肽的活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系仍處于解釋階段。

生物活性多肽在母體蛋白序列中是不活躍的，它可以在食品加工過程中產(chǎn)生，也可以通過微生物發(fā)酵或通過化學/酶水解從前體食物蛋白中產(chǎn)生[4-5]。根據(jù)氨基酸序列的不同，這些肽可能在體內(nèi)發(fā)揮多種不同的活性，影響心血管、內(nèi)分泌、消化、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)。迄今為止，在食品中發(fā)現(xiàn)的生物活性肽主要有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗血栓、阿片類、礦物質(zhì)結(jié)合、抗氧化、抗高血壓、低膽固醇等功能特性[6-8]?；鹜茸鳛橐环N發(fā)酵肉制品，富含蛋白質(zhì)，在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)受到組織內(nèi)源性酶以及微生物酶的作用，降解產(chǎn)生許多小分子肽段[9]，有些研究表明部分肽段具有生物活性，因此本文主要綜述了火腿中生物活性肽的產(chǎn)生機制、功能特性、制備方法以及分離純化的研究進展，旨在為生物活性肽進一步的研究與開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 火腿中生物活性肽的產(chǎn)生機制

火腿的整個加工時間很長，從腌制到成熟要經(jīng)歷冬、春、夏、秋4 個季節(jié)，一般傳統(tǒng)的加工過程長達8～10 個月，在此期間內(nèi)源性酶伴隨著環(huán)境的溫濕度變化而表現(xiàn)出不同的活性。由于特定的溫濕度條件，使得肌肉蛋白質(zhì)和脂肪在相應的酶作用下發(fā)生降解產(chǎn)生許多長短不一的多肽、游離氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物?；鹜戎须牡姆肿恿看笮∨c火腿的加工時長關(guān)系密切，加工時間較短的，所產(chǎn)生的肽的分子量較大。反之，肽的分子量較小，而分子量大的肽會因加工時間的延長進一步降解為分子量較小的肽[10]。引起蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用的酶類有多種，如內(nèi)源組織蛋白酶、微生物酶等，其中內(nèi)源組織蛋白酶B、L、H、D、鈣激活中性蛋白酶等內(nèi)切酶起主要作用，在火腿的整個加工過程中組織蛋白酶B 或B+L 活性始終良好[11]。而外切蛋白酶如三肽酶、二肽酶、氨肽酶、羧肽酶等會對低分子量小肽的產(chǎn)生具有重要作用?；鹜戎械鞍姿庾饔脮?jīng)過3 個階段，其變化與通過Z 盤肌原纖維的破碎程度有關(guān)[12]：蛋白組織關(guān)鍵性內(nèi)切酶B、L 等首先對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白進行水解，產(chǎn)生許多蛋白質(zhì)碎片以及中等大小的多肽，然后外切酶二肽酶、三肽酶再將其進一步降解為短肽。Rodriguez 等[13]研究了Sarrano 火腿加工中肽的生成，結(jié)果表明火腿中多肽的組成可分為5 個分子量范圍，即 4 500 Da～2 700 Da、2 700 Da～1 200 Da、1 200 Da～500 Da、500 Da～375 Da 和 375 Da～160 Da。Zhao 等[14]的研究結(jié)果表明金華火腿加工過程中蛋白質(zhì)會發(fā)生不同程度的降解，并從曬腿結(jié)束、成熟中期、成熟后期3 個時期的火腿中分別鑒定出43、46、63 種主要的小肽。這說明了火腿加工過程中會產(chǎn)生和積累大量多肽及小肽類物質(zhì)。對于火腿中產(chǎn)生的肽類物質(zhì)的功能特性有待進一步的研究，以完善其功效。

2 火腿中生物活性肽的功能特性

2.1 ACE抑制活性

肉類蛋白衍生生物活性肽研究最廣泛的是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽[7，15]。這些多肽因其能預防高血壓而備受關(guān)注，高血壓是心血管疾病發(fā)展的危險因素，是當今最常見的慢性生活方式相關(guān)疾病（chronic lifestyle-related diseases，CLSRDs）之一。ACE 抑制肽可作為有效的功能性食品添加劑，是一種天然、健康的高血壓藥物替代品。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶I 是一種二肽酰羧肽酶，它能將一種非活性形式的血管緊張素I 轉(zhuǎn)化為有效的血管收縮劑血管緊張素II。ACE 是一種多功能酶，能使一種已知的血管舒張劑失活，還可以發(fā)揮抗高血壓作用[15]。在食物蛋白的酶水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了大量的ACE 抑制肽[16-17]，食物中分離的ACE 抑制肽對正常血壓無影響，具有天然性、高安全性的優(yōu)點。同時，食源性ACE 抑制肽有促進降血糖血栓、增強人體免疫力等復合功效。目前，已有國內(nèi)外學者對火腿中肽的ACE 抑制活性進行了體外試驗和動物實驗研究。Mora 等[18]的研究指出，自發(fā)性高血壓大鼠攝入伊比利亞干腌火腿的肽提取物8 h 后，收縮壓顯著下降了12 mmHg，分析結(jié)果鑒定了2 632 個含有上述ACE 抑制片段的肽序列PPK、PAP 和AAP。有人研究了干腌火腿加工過程中自然產(chǎn)生的肽，顯示出ACE 抑制活性，還研究了肽在Caco-2 細胞單層的跨上皮轉(zhuǎn)運過程中的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示其能夠被腸道上皮吸收并到達血流以發(fā)揮抗高血壓作用[19]。在體外試驗中，水溶性成分和洗脫組分都顯示出體外血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。在最近的研究中[20]，已經(jīng)檢測了一種富含ACE抑制活性肽的西班牙干腌火腿提取物在熱處理和體外消化過程中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，加工的西班牙干腌火腿提取物中的肽在差熱50 ℃～117 ℃前后、不同時間和模擬體外消化過程中幾乎保持了相同的ACE 抑制活性。肽 KAAAAP、AAPLAP KPVAAP、IAGRP KAAAATP是最活躍的，IC50值在 12.37 μmol/L～25.94 μmol/L 之間。Escuderoa 等[21]的研究指出，在西班牙干腌火腿中發(fā)現(xiàn)了新的具有體外ACE 抑制活性的序列，并且在體內(nèi)這些序列也有抗高血壓活性。王樂等[22]通過研究金華火腿加熱烹飪以及加熱烹飪-體外模擬消化后提取的粗肽發(fā)現(xiàn)其均具有ACE 抑制活性和抗氧化性，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)從處理過的金華火腿中提取的粗肽的ACE 抑制活性更高。綜上，火腿活性肽具有較強的ACE 抑制活性，通過適當?shù)奶幚頃鰪娝幕钚?。相關(guān)研究大多從體外ACE 抑制試驗對其評估，缺乏體內(nèi)試驗、細胞試驗等的驗證，ACE 抑制機制也尚未清楚，還需全面深入地研究。

2.2 抗氧化性

自由基是帶有一個或幾個不成對電子的原子、分子或基團，通?；瘜W性質(zhì)不穩(wěn)定，有奪取電子的傾向。隨著對自由基的深入研究，生物體患的多種疾病以及出現(xiàn)的衰老問題均與體內(nèi)產(chǎn)生過量自由基有關(guān)[23]。自由基是生物體正常新陳代謝的重要參與者，如羥自由基、超氧陰離子和一氧化氮自由基等。人體衰弱或機體衰老時，不能完全清除體內(nèi)的自由基，過多的氧自由基堆積在細胞內(nèi)會與大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等發(fā)生反應，產(chǎn)生大量的氧化物或過氧化物，對人體細胞組織產(chǎn)生破壞，而抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)可保護生物分子免受自由基的侵害[24]。天然抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化、螯合過渡金屬離子和降低細胞自氧化速率，并且能夠有效捕獲并中和自由基從而減少自由基對人體損壞的一類活性物質(zhì)。已有研究人員從動植物、微生物、水產(chǎn)品以及乳制品中獲取了抗氧化肽[25-29]，并證實了其具有清除自由基能力、活性高、安全低毒等優(yōu)點。據(jù)研究表明，干腌火腿中存在生物活性肽，其具有抗氧化、降血壓、抑菌等活性。鄭錦曉等[30]研究了宣威火腿、金華火腿和如皋火腿中多肽的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)3 種火腿均具有鐵離子還原能力和ABTS+自由基清除能力、氧自由基清除能力和一定的DPPH 自由基清除能力，且宣威火腿的鐵離子還原能力和ABTS+自由基清除能力、氧自由基清除能力均高于其他兩種。王樂等[22]的研究表明，金華火腿具有一定的抗氧化性，加熱烹飪后，金華火腿粗肽的ABTS·+清除率和Fe2+螯合能力降低，而DPPH 自由基清除率和氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）有所提高；加熱烹飪-體外模擬消化金華火腿后 Fe2+螯合能力、ABTS·+清除率和 ORAC 均升高，這些結(jié)果顯示出評價其活性的指標發(fā)生了變化，雖然它的變化趨勢不完全一致，但仍存在一定的活性。周小理等[31]研究了金華火腿水提物體外抗氧化活性，結(jié)果表明，金華火腿水溶性提取物及超濾后的不同分子量的分離物均具有較高的抗氧化活性，其中，水溶粗提物的抗氧化活性隨著濃度的增大而增強。從結(jié)果中可以看出抗氧化活性與分子量大小有關(guān)，分子量越小，抗氧化活性越強。Escudero 等[21，32]研究了西班牙干腌火腿，結(jié)果表明，西班牙干腌火腿中含有抗氧化肽和抗高血壓肽，部分肽段具有DPPH 自由基清除活性和超氧陰離子清除能力。邢路娟等[33]對從宣威火腿中提取的粗肽進行了體外抗氧化試驗，結(jié)果表明，宣威火腿發(fā)酵過程中所形成的粗肽物質(zhì)具有抗氧化活性。吳寶森[34]對諾鄧火腿粗肽進行了體外抗氧化試驗及分離純化與鑒定，結(jié)果表明諾鄧火腿粗肽具有一定的抗氧化性，且隨著質(zhì)量濃度的增大抗氧化活性增強；通過鑒定得到了8 個抗氧化肽序列。Xing 等[35]研究了宣威火腿中粗多肽的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其具有較高的抗氧化活性。研究表明火腿中的肽具有較高的抗氧化活性，大多數(shù)研究是從體外抗氧化試驗來評價它的抗氧化作用，缺乏動物實驗、臨床試驗、細胞試驗等，抗氧化需要多種檢測方法來綜合評價，而且各種火腿由于發(fā)酵條件不同產(chǎn)生的抗氧化肽也不同，需全面深入地研究其發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。

2.3 抑菌性

抗菌肽一般是指能抑制或殺滅微生物的多肽或寡肽，是宿主非特異性防御系統(tǒng)的重要組分，多數(shù)抗菌肽由12～60 個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量小于10 kDa?？咕耐ǔＳ袃捎H結(jié)構(gòu)，N 端含親水性氨基酸殘基，C 端含疏水性氨基酸殘基，這使抗菌肽能與兩性分子構(gòu)成的細胞膜結(jié)合。Castellano 等[36]對西班牙干腌火腿粗肽進行分離并測定其抑制李斯特菌的能力，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS） 鑒定得到具有較好抑菌能力的肽段RHGYM。鄭錦曉等[30]的研究結(jié)果表明，金華火腿、宣威火腿和如皋火腿中粗多肽有抑制大腸桿菌的能力，且抑制大腸桿菌的能力隨著肽濃度的升高而增大。目前，國內(nèi)外對干腌火腿多肽抑制微生物能力的研究鮮有報道，具有潛在的研究價值。

2.4 其他

火腿多肽還具有其他的功能特性如乳化性等，它是由于多肽的雙親性，使其在食品中扮演著乳化作用的角色，其乳化性對產(chǎn)品的質(zhì)地和口感起著重要作用。食源乳化性的肽因其具有易吸收、毒性小或無毒副作用等優(yōu)點而備受青睞。肽的乳化性與食品加工和食品質(zhì)量控制關(guān)系密切，而蛋白肽的乳化性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，蛋白質(zhì)水解之后，分子量降低，離子基團數(shù)量增加，使疏水基團暴露從而改變多肽的性質(zhì)。有研究者[37]研究了金華火腿粗多肽的功能特性，發(fā)現(xiàn)其具有良好的乳化特性，乳化能力、乳化穩(wěn)定性指數(shù)、黏度均與多肽濃度呈正相關(guān)，乳狀液粒徑隨著多肽濃度的增加而減小，乳化活性指數(shù)與濃度呈負相關(guān)。這一研究彌補了金華火腿乳化特性的研究空白，為完善火腿的功效提供理論依據(jù)。

3 火腿中生物活性肽的制備與分離純化

3.1 生物活性肽的制備

生物活性肽的制備方法有多種，比如直接提取法、酶解法[25]、微生物發(fā)酵法[38]等。而火腿中的肽一般采用鹽酸或磷酸鹽緩沖液來提取，羅雨婷等[39]用0.2 mol/L pH 7.2 的磷酸緩沖液從諾鄧火腿中提取出具有抗氧化性的粗肽；鄭錦曉等[30]用磷酸緩沖液從金華火腿、如皋火腿、宣威火腿中提取了具有抗氧化活性和抑制大腸桿菌的粗肽；Escudero 等[19，31]用 0.01 mol/L 鹽酸溶液從西班牙火腿中提取出具有抗氧化性和抗高血壓的短肽；忽曉平[37]研究了鹽酸、磷酸鹽緩沖溶液兩種浸提液和乙醇體積分數(shù)對金華火腿粗多肽提取效果，結(jié)果表明，偏酸性條件下，金華火腿中多肽提取效果較好。通過研究金華火腿粗多肽中含有抗氧化性和乳化特性；鄭錦曉等[40]用磷酸緩沖液提取傳統(tǒng)工藝和新工藝金華火腿中的粗肽，結(jié)果表明，傳統(tǒng)工藝粗肽粉的肽含量顯著高于新工藝的，且兩種加工方式中的粗肽具有不同的抗氧化性；韓冬雪[41]用不同體積（5、10、15、20、30 mL）相同濃度的鹽酸（0.01 mol/L）提取了發(fā)酵牛肉火腿中的ACE 抑制肽，結(jié)果表明，用15 mL 0.01 mol/L的鹽酸提取更合適，這是由于蛋白質(zhì)濃度達到一定時，隨著鹽酸量的增加，提取物中蛋白質(zhì)含量也會降低導致的；馬志方[42]用0.01 mol/L 鹽酸提取了低鈉金華火腿中的多肽，研究結(jié)果表明，低鈉金華火腿具有抗氧化活性和ACE 抑制活性。在提取活性肽時，不同的提取條件獲得的活性肽可能不同，同時也可能會影響活性肽的穩(wěn)定性，在今后仍需要進一步研究。

3.2 生物活性肽的分離純化

分離純化是生物活性肽研究中的重要部分，為了進一步研究肽的生物活性及其作用機制，常用的分離純化方法有凝膠色譜法、離子交換層析[43]、超濾法[44]、反相高效液相色譜法[45]等，這些方法各有利弊，常常將幾種方法結(jié)合使用來分離純化多肽。胡亞亞[46]通過Sephadex G-25 凝膠色譜對金華火腿粗肽液進行分離得到5 個組分，其中組分C 表現(xiàn)出最強的清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的能力。忽曉平[37]采用超濾法對金華火腿粗多肽進行分離，得到了分子量大小為＞10 KDa、3 KDa～10 KDa、＜3 KDa 的 3 個肽段，經(jīng)研究3 個肽段均具有一定的乳化性和抗氧化性，且分子量越小，抗氧化性越強。吳寶森[34]利用Sephadex G-25凝膠色譜和Sephadex G-15 凝膠色譜分離純化粗肽后，通過體外抗氧化試驗得出組分C3的抗氧化活性最強，進一步通過MALDI-TOF-MS 鑒定C3組分得到8個抗 氧 化 肽 序 為 ：QVTSLSGQcHHHDEK、VHQYFN VGLIQPGSVK、QNLLSQSHAHQQFLR、GcFKPIVAGD -QNVEYK、AIQISYNPEDLSKPDR、NLHPELGTDADKE -HWK、IRELESQISELQEDLESER、IHVSDQELQSANASVDDSRLEELK；祝超智[47]借助凝膠層析色譜對金華火腿粗肽液進行初步分離，通過抗氧化試驗和模擬胃腸道消化試驗，分別選出消化前后活性強的組分采用反相高效液相色譜進一步分離純化，用質(zhì)譜鑒定出了7 條具有抗氧化活性的肽段，其中，清除羥基自由基活性最強的肽段為LPGGGHGDL。Xing 等[48]通過使用陰離子交換柱和反相高效液相色譜分離宣威干腌火腿中抗氧化活性較強的組分，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS） 鑒定得到 ASP-LU-Glu Glu、SerPro Gly Pro、Ser-GLY-TYR 和 PRO-LU-PRO 是宣威火腿抗氧化活性的主要肽類。Escuderoa 等[21]利用尺寸排阻層析和反向高效液相色譜純化西班牙干腌火腿提取物中水溶性多肽后，用納米液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定得到最有效的ACE 抑制肽序列為AAATP。目前用于純化火腿多肽的方法有多種，但一種單一的分離純化方法難以獲得高純度、單一組分的火腿多肽，因而需要采用幾種方法聯(lián)用才能獲得高純度的活性肽。

4 結(jié)論與展望

生物活性肽具有多種功能特性，含有多種潛在的對人體健康有益的生物活性，如抗氧化性、ACE 抑制性、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗癌、抗炎等，對開發(fā)功能食品、營養(yǎng)保健品以及食品添加劑等具有潛在可能性。火腿在長期的發(fā)酵過程中，由于蛋白水解作用產(chǎn)生許多小分子肽類物質(zhì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)部分肽段具有生物活性。國內(nèi)外對火腿生物活性肽的研究起步較晚，目前，從火腿中發(fā)現(xiàn)的活性肽有抗氧化肽、ACE 抑制肽、抑菌肽，對這些活性肽的研究還較少而且不全面，主要是對其進行體外試驗來評價它的活性，對于活性肽的分離純化以及空間構(gòu)象的研究較少，缺乏細胞試驗、臨床試驗、動物試驗等來檢測活性肽的作用機制。人們主要研究了西班牙干腌火腿、宣威火腿、諾鄧火腿與金華火腿中的部分活性肽，對其他火腿活性肽的研究較少。不同地區(qū)的火腿，氣候、地理環(huán)境以及加工工藝之間存在差異，使其發(fā)酵條件不同，導致火腿在發(fā)酵過程中蛋白水解程度不一樣，產(chǎn)生的生物活性肽也會有差異。綜上所述，火腿中的生物活性肽具有很大的研究意義，需進一步加強研究，以期能夠開發(fā)出對人體有益并具有特殊功能特性的肽類產(chǎn)品。