陳燕 杜奕奇

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433

【提要】 熱休克蛋白70(HSP70)在急性胰腺炎(AP)時(shí)通過同時(shí)抑制胰蛋白酶原和NF-κB炎癥通路的激活來發(fā)揮胰腺腺泡細(xì)胞的損傷保護(hù)作用；HSP70多態(tài)性可能與AP患者病情嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，激動(dòng)過氧化物酶體增殖物激活受體γ可能通過增加腺泡細(xì)胞內(nèi)熱休克因子1 /HSP70的激活轉(zhuǎn)錄減輕AP嚴(yán)重程度，而激動(dòng)劑的可選擇性可能為臨床選擇藥物救治AP提供安全、有效的可能。

1962年，Ritossa[1]在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)了一個(gè)現(xiàn)象，即在較高溫度下孵化的果蠅唾液腺中的核酸合成增加。由于該現(xiàn)象發(fā)生在細(xì)胞暴露于高溫下時(shí)，他便提出“熱休克反應(yīng)”這個(gè)術(shù)語。最初發(fā)現(xiàn)的熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)的分子質(zhì)量都在70×103范圍以內(nèi)，隨后發(fā)現(xiàn)了與熱休克反應(yīng)相關(guān)的多個(gè)蛋白，分子質(zhì)量為(15～110)×103[2-4]。接著在多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中發(fā)現(xiàn)了這些HSP，分子質(zhì)量大的HSP依賴于ATP，在常溫或應(yīng)激溫度下表達(dá)，具有一系列不同的功能，包括蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)位、細(xì)胞保護(hù)及調(diào)節(jié)凋亡等[5]；分子質(zhì)量較小的HSP通常有組織特異性，不依賴ATP，具有蛋白質(zhì)折疊伴侶和抗凋亡功能[6]。HSP家族中最保守和研究最充分的是HSP70超家族。它們依賴ATP，分子質(zhì)量為(66～78)×103，由一組11個(gè)人類基因編碼。這些蛋白的水平受熱休克因子(heat shock factor，HSF)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。HSF由HSF1、HSF2、HSF3和HSF4組成，它們的功能相互獨(dú)立又相互重疊，表達(dá)模式具有組織特異性。其中，HSF1是主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是HSP基因反式激活和維持耐熱性所必需的[7]。HSF1在應(yīng)激期間被誘導(dǎo)與HSP70的啟動(dòng)子結(jié)合以增加其轉(zhuǎn)錄?？烧T導(dǎo)的HSP70對(duì)廣泛的刺激敏感，具有良好的治療潛力。本文就其在急性胰腺炎(AP)中的作用及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、AP的酶原激活理論

AP是一種胰腺炎癥疾病，最終導(dǎo)致腺泡細(xì)胞損傷和死亡。在生理?xiàng)l件下，消化酶由胰腺腺泡細(xì)胞合成、儲(chǔ)存和分泌，各種保護(hù)機(jī)制使消化酶在腺泡細(xì)胞內(nèi)免于被激活[8]。然而，在AP期間各種刺激導(dǎo)致消化酶酶原在腺泡細(xì)胞內(nèi)被激活，進(jìn)而也激活了腺泡細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)途徑[9]。研究表明，在AP早期消化酶酶原與溶酶體融合，胰蛋白酶原被激活為胰蛋白酶[10-11]。與此同時(shí)，NF-κB依賴的促炎途徑被激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子從腺泡細(xì)胞釋放，從而放大胰腺局部和全身多器官的損傷[12]。

二、HSP70對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

HSP70在AP體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中通過以上發(fā)病機(jī)制發(fā)揮其保護(hù)作用。這些研究主要通過熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激(化學(xué)應(yīng)激源，如β-腎上腺素、亞砷酸鈉等非熱藥物)使胰腺腺泡細(xì)胞過表達(dá)HSP70實(shí)現(xiàn)的。Wagner等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠胰腺的腺泡細(xì)胞暴露于熱應(yīng)激時(shí)，分子質(zhì)量為72×103的HSP70表達(dá)明顯增加；進(jìn)一步觀察到HSP70的過度表達(dá)對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AP大鼠器官損傷具有保護(hù)作用，且HSP誘導(dǎo)的強(qiáng)度與器官損傷保護(hù)程度密切相關(guān)。除熱應(yīng)激外，通過非產(chǎn)熱方法誘導(dǎo)HSP70過表達(dá)的AP模型中也觀察到類似的保護(hù)作用。β-腎上腺素誘導(dǎo)HSP70過表達(dá)可保護(hù)小鼠免受雨蛙素誘導(dǎo)的AP胰腺損傷，同時(shí)阻止胰蛋白酶原早期激活[14]。亞砷酸鈉誘導(dǎo)的HSP70過表達(dá)在雨蛙素以及L-精氨酸誘導(dǎo)的AP模型中也提供保護(hù)作用，表現(xiàn)為高淀粉酶血癥、胰腺水腫和腺泡細(xì)胞壞死程度明顯減輕；亞砷酸鈉預(yù)處理不僅能抑制胰蛋白酶原活化，而且在體內(nèi)和體外都能通過抑制IκBα的降解阻止NF-κB向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位[15]。AP的酶原激活機(jī)制認(rèn)為消化酶酶原和溶酶體酶共定位是腺泡內(nèi)胰蛋白酶激活所必需的。HSP70保護(hù)腺泡細(xì)胞的機(jī)制之一就是干擾酶原顆粒和溶酶體酶的共定位[15]。共定位需要Ca2+內(nèi)流的初始激增以及隨后的持續(xù)增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的螯合可以抑制共定位[16]。對(duì)非胰腺細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)HSP70可以減弱細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加[17]。除了抑制腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的激活外，HSP70的過表達(dá)還通過增加其內(nèi)源性抑制劑IκBα的水平來降低NF-κB的激活[18]。這些研究證明了HSP70對(duì)AP的腺泡細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用通過同時(shí)抑制胰蛋白酶原活化和NF-κB激活實(shí)現(xiàn)，且與HSP70的誘導(dǎo)方式無關(guān)。

值得一提的是，雖然熱應(yīng)激和化學(xué)藥物誘導(dǎo)的主要蛋白是HSP70，但這些干預(yù)也誘導(dǎo)了其他多種HSPs，因此這些干預(yù)所觀察到的保護(hù)作用是否是HSP70過表達(dá)之外的事件引起的，Bhagat等[19]對(duì)此進(jìn)行了研究。他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中用反義寡核苷酸和藥理兩種方法抑制HSP70過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導(dǎo)的AP胰腺損傷中未出現(xiàn)保護(hù)作用，說明對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺保護(hù)作用是由熱應(yīng)激后的HSP70介導(dǎo)的；然后他們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明了HSP70對(duì)胰腺損傷的保護(hù)作用，即在熱應(yīng)激前給予抑制HSP70的反義寡核苷酸，此時(shí)有其他應(yīng)激蛋白表達(dá)，但HSP70未表達(dá)，對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺損傷也失去保護(hù)作用，表明這種保護(hù)作用是通過過表達(dá)的HSP70介導(dǎo)的；但在熱應(yīng)激前給予HSP70的正義寡核苷酸組，熱應(yīng)激對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AP保護(hù)作用仍然存在，因?yàn)镠SP70的過表達(dá)未受到影響。該項(xiàng)研究說明，熱應(yīng)激等干預(yù)手段對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AP保護(hù)作用就是通過誘導(dǎo)HSP70過表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

三、HSP70多態(tài)性預(yù)測(cè)AP嚴(yán)重程度

人類編碼HSP70的主要基因(即HSP70.2)A～G多態(tài)性導(dǎo)致誘導(dǎo)性HSP70.2 mRNA表達(dá)水平較低(即HSP70.2基因中具有純合G等位基因)。Balog等[20]發(fā)現(xiàn)HSP70多態(tài)性與AP嚴(yán)重程度之間存在關(guān)聯(lián)。與輕癥AP組(29例)、健康對(duì)照組(71例)相比，重癥AP組(48例)中有較多的患者具有HSP70.2G等位基因多態(tài)性，認(rèn)為HSP70.2G等位基因的高頻率與重癥AP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。HSP70水平或多態(tài)性未來可能有助于預(yù)測(cè)AP嚴(yán)重程度和患者預(yù)后，基因型評(píng)估也可用于指導(dǎo)治療或識(shí)別重癥AP的危險(xiǎn)人群。而Srivastava等[21]對(duì)50例AP患者和50例健康獻(xiàn)血員進(jìn)行前瞻性研究，同樣用PstI限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法確定HSP70.2基因的3個(gè)等位基因(AA、AG和GG)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP患者HSP70.2G等位基因頻率明顯高于對(duì)照組。然而，該多態(tài)性與疾病嚴(yán)重程度和并發(fā)癥均無關(guān)。筆者認(rèn)為上述2項(xiàng)研究病例數(shù)量少是主要缺陷，在這方面，中國(guó)AP患者例數(shù)顯示出研究?jī)?yōu)勢(shì)，但目前缺乏中國(guó)人群相關(guān)數(shù)據(jù)。

四、HSP70在AP研究中的進(jìn)展

如上所述，HSP70在AP的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中都表現(xiàn)出胰腺保護(hù)能力。除此之外，有研究者認(rèn)為HSP70基因評(píng)估也可用于指導(dǎo)治療或識(shí)別重癥AP的危險(xiǎn)人群。但在臨床實(shí)際應(yīng)用方面，HSP70至今沒有用作預(yù)測(cè)指標(biāo)，目前也缺乏誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的藥物。

HSP70用作臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)困難與其生物學(xué)特性有關(guān)：即正常情況下HSP70在細(xì)胞內(nèi)(胞核、胞質(zhì)或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu))呈基礎(chǔ)表達(dá)水平；而在高溫、化學(xué)藥物及各種有害應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70在細(xì)胞內(nèi)的合成速度顯著增加，以提高生物體的抗應(yīng)激和抗炎能力，在這些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)HSP70均在細(xì)胞水平，且HSP70的過表達(dá)對(duì)細(xì)胞和器官均有保護(hù)作用[13-15，22-24]。因此，如果在AP患者血液、體液檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)較高表達(dá)水平的HSP70，表明病情可能較重。HSP70的保護(hù)作用發(fā)生在細(xì)胞水平，如果細(xì)胞損傷甚至壞死，腺泡細(xì)胞內(nèi)的HSP70釋放，甚至?xí)透哌w移率族蛋白1(high-mobility-group box 1，HMGB1)一樣成為潛在的損傷相關(guān)分子(damage associated molecular pattern，DAMP)[18,25-26]。近期有研究報(bào)道重癥AP患者血清中HMGB1濃度升高，伴有炎癥因子的增加，而HSP70濃度降低，因而認(rèn)為HSP70是保護(hù)性蛋白[27]。而我國(guó)學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡細(xì)胞外給予HSP70可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，其中Toll樣受體-4可能參與激發(fā)HSP70介導(dǎo)的SIRS[18]。這兩項(xiàng)無法相互解釋的研究也側(cè)面說明HSP70研究的復(fù)雜性，以及其不能作為預(yù)測(cè)指標(biāo)的原因。實(shí)際上，在細(xì)胞水平，HSP70通過多種機(jī)制抑制SIRS，其中之一就是減少HMGB1的細(xì)胞外分泌和釋放[23-24]。

在誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)生成HSP70方面，如前所述亞砷酸鈉是灰白色的固體，易溶于水，有劇毒，主要用于農(nóng)藥和殺蟲劑。而β腎上腺素主要作用于心臟、血管平滑肌和支氣管平滑肌的β受體，小劑量即可興奮心臟β1受體，產(chǎn)生正性肌力作用，用于心臟驟停、過敏性休克的救治，使用β腎上腺素誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞HSP70表達(dá)時(shí)會(huì)有較明顯的藥物不良反應(yīng)。如前所述，HSF1在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)被誘導(dǎo)與HSP70的啟動(dòng)子結(jié)合以增加其轉(zhuǎn)錄合成。Bhagat等[19]發(fā)現(xiàn)HSF1基因敲除小鼠的HSP70合成減少，小鼠表現(xiàn)為更嚴(yán)重的AP。因此，增加HSF1/HSP70激活轉(zhuǎn)錄即能誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞內(nèi)HSP70過度表達(dá)，而如何激活HSF1目前在AP研究中尚未涉及。在心肌細(xì)胞再灌注損傷中，研究者發(fā)現(xiàn)使用過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的天然配體15d-PGJ2可以增加HSF1的DNA結(jié)合并上調(diào)HSP70的合成，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用；而PPARγ的合成激動(dòng)劑吡格列酮也能減輕心肌細(xì)胞損傷和NF-κB炎癥通路的激活[28]。有研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以調(diào)控AP胰腺腺泡細(xì)胞線粒體功能，發(fā)揮保護(hù)腺泡細(xì)胞的作用[29]。筆者推測(cè)激動(dòng)PPARγ可能通過增加腺泡細(xì)胞內(nèi)HSF1/HSP70的激活轉(zhuǎn)錄減輕了AP嚴(yán)重程度。另一方面，PPARγ激動(dòng)劑的可篩選性也為臨床選擇藥物救治AP提供安全、有效的可能。

綜上所述，HSP70通過抑制胰蛋白酶原的腺泡內(nèi)激活和NF-κB炎癥通路的激活來介導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞的損傷保護(hù)，HSP70的保護(hù)作用只發(fā)生在細(xì)胞水平，如果發(fā)生細(xì)胞損傷甚至壞死，腺泡細(xì)胞內(nèi)的HSP70則有可能成為潛在的DAMP，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)HSP70過表達(dá)的藥物具有較高的不良反應(yīng)，PPARγ激動(dòng)劑的多品種化提供臨床選擇合適治療藥物的可能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突