張祥濤 劉睿清 張憲祥 盧云

結直腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。其中，V-raf鼠肉瘤毒癌基因同源體B（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog，BRAF）V600E突變的結直腸癌是一種獨特的結直腸癌分子亞型，具有特殊的分子和臨床病理特征，惡性程度高且缺乏有效的治療手段，患者預后極差。BRAF V600E基因突變還常見于惡性黑色素瘤、甲狀腺乳頭狀癌等。既往研究聚焦于通過阻斷關鍵激酶BRAF和MEK活性抑制信號通路，盡管針對這些靶點的靶向藥物在黑色素瘤臨床治療中取得了顯著療效，但也面臨單藥治療快速耐藥的問題，其結果是腫瘤細胞通過各種機制重新激活MAPK信號通路[1-3]。而BRAF V600E結直腸癌患者中BRAF V600E和MEK靶向藥物單藥和聯(lián)合使用療效遠不及黑色素瘤[4-5]。本文將重點討論BRAF V600E基因突變在結直腸癌診治中的最新進展。

一、BRAF基因突變與結直腸癌演進

1.結直腸癌分子遺傳學改變與BRAF基因突變

結直腸癌是通過多種遺傳和表觀遺傳途徑發(fā)展的，主要有三條途徑：染色體不穩(wěn)定（chromosomal instability，CIN）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）以及CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）等途徑[6-8]。這些途徑均具有特定的病理特征、致癌機制和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。這些通路的分子方面已被臨床用于結直腸癌的診斷、篩選和管理。

Lengauer等[9]在非整倍體腫瘤細胞中首次證實CIN的存在。CIN指的是DNA片段受到缺失或擴增事件影響的拷貝數(shù)畸變（CNA）的獲得率[10]。它存在于絕大多數(shù)結直腸癌中（約70%）[11]，可導致APC、TP53等抑癌基因和KRAS等癌基因發(fā)生一些有害突變[12-13]，所以它和結直腸癌的復發(fā)風險、轉移風險[14]及存活率[15]等密切相關。CIN在BRAF野生型的傳統(tǒng)腺瘤中發(fā)生，并通過“傳統(tǒng)途徑”向惡性進展。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite stability，MSI）是由于DNA錯配修復（mismatch-repair，MMR）基因的種系/體細胞突變導致的DNA錯配修復系統(tǒng)缺陷。MSI腫瘤的發(fā)生受錯配修復基因失活的驅動，錯配修復基因通過修復DNA復制錯誤、抑制非相同DNA序列的重組以及干擾對DNA損傷的反應，在揭示遺傳穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關鍵作用。DNA-MMR系統(tǒng)包括四種眾所周知的蛋白質：MLH1、MSH2、PMS2和MSH6，它們作為異質二聚體相互作用[16]。

在結直腸癌中，MSI檢測分為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（MSI-H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定性（MSI-L）和微衛(wèi)星穩(wěn)定性（MSS）。MSI約占所有結直腸癌腫瘤的8%～20%，Ⅱ期（20%）比Ⅲ期（12%）和Ⅳ期（4%）更常見[11，17]。近年來，很多學者研究表明BRAF基因突變與MSI影響結直腸癌患者的預后。Sinicrope等[18]研究發(fā)現(xiàn)MSI結直腸癌比MSS-結直腸癌具有更好的預后和更少的轉移。其他研究也表明，與MSS/MSI-L結直腸癌患者相比，Ⅱ期病理腫瘤的MSI-H結直腸癌患者預后更好，復發(fā)風險更低[19]。BRAF突變型/MSI癌癥預后良好，其次是BRAF野生型/MSS癌癥，而BRAF突變型/MSS癌癥的預后非常差[20-21]，但分子機制仍不清楚。Bond等[22]研究發(fā)現(xiàn)在BRAF突變型/MSS癌癥中存在明顯的高水平CIN，且這種類型越接近晚期，總CIN水平升高越顯著。不同的是BRAF野生型/MSS癌在早期和晚期的CIN發(fā)生率相當。該研究還發(fā)現(xiàn)BRAF突變型/MSS癌與BRAF野生型/MSS癌的p53突變率相當，明顯高于BRAF突變型/MSI癌的p53突變率。這可能是該類型癌癥預后差的原因。Koinuma等[23]研究證實BRAF突變癌主要發(fā)生在近端結腸。Bond等[22]同樣證實大部分BRAF突變型/MSS的癌癥來自該區(qū)域（約69%），但近端癌與遠端癌的CIN發(fā)生率無差異。Sérgia等[24]研究發(fā)現(xiàn)在結直腸癌中MSI組BRAF突變率明顯高于MSS組（分別為28%和7.5%）。研究還顯示MSI結直腸癌比MSS結直腸癌更容易發(fā)生BRAF V600E基因突變[25-26]。

Toyota等[27]解釋了CpG島甲基化表型（CIMP）是另一種致瘤途徑。CpG島是指CpG二核苷酸聚集區(qū)域。在活化基因的5′非編碼區(qū)啟動子內(nèi)，CpG島都是去甲基化狀態(tài)[28]。啟動子區(qū)CpG島（亦稱5′CpG島）甲基化將直接或間接地抑制轉錄，所以它可以抑制下游基因表達。結腸直腸癌中的CIMP可能通過一種獨特的途徑發(fā)生，這種途徑起源于某些亞型的鋸齒狀息肉[29]，在所有結腸直腸癌病例中約有15%的CIMP存在[30-31]。Weisenberger等[32]發(fā)現(xiàn)CIMP陽性（CIMP＋）腫瘤包含大部分情況下的腫瘤BRAF突變。偶見的錯配修復缺陷幾乎完全是由于CIPM相關的MLH1甲基化所致。依據(jù)CIPM在BRAF基因突變鋸齒狀腺瘤中的表達，將腺瘤分為的3個組：高CpG島甲基化表型（CIMP-1）、低CpG島甲基化表型（CIMP-2）和非CIMP分組，3個組在結直腸癌中的突變率分別為77%、18%和0（P＜0.0001）[33]。說明BRAF基因突變和CpG島甲基化有關。一些研究發(fā)現(xiàn)BARF V600E基因發(fā)生突變，可以使細胞對凋亡刺激產(chǎn)生抵抗，使得MLH1基因啟動子CpG島發(fā)生甲基化，而使細胞發(fā)生MSI[34-35]。Bond等[22]在BRAF突變體/MSS癌癥中，CIN和CIMP同時出現(xiàn)的頻率很高（72%）。

2.BRAF基因突變及MAPK信號通路

RAS/MAPK通路與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT通路共同構成了參與癌癥發(fā)生的基因轉錄的連續(xù)磷酸化級聯(lián)反應后最著名的信號傳遞通路之一。MAPK/ERK信號級聯(lián)將有絲分裂和其他刺激信號從細胞膜上的受體（如EGFR）傳遞到細胞核。細胞表面受體下游的Ras小胍三磷酸酶（GTPase）激活絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白RAF家族，導致MAPK和ERK激酶（MEK）蛋白磷酸化和活化，隨后磷酸化并激活ERK蛋白。ERK蛋白激活后磷酸化多種底物，包括多種轉錄因子，并調控細胞增殖、遷移、血管生成和抑制凋亡等幾個關鍵的細胞活動[36]。RAF家族還包括ARAF和CRAF，但BRAF具有最強的基礎激酶活性，是MEK/ERK蛋白最有效的激活劑。

MAPK/ERK信號通路的異常激活參與了許多人類惡性腫瘤[37]。在實體腫瘤中，BRAF突變的發(fā)生率最高，V600E替代約占突變的80%，與野生型蛋白相比，BRAF中的所有突變都具有更高的激酶活性，從而刺激MAPK/ERK活性。

3.BRAF基因突變與KRAS基因突變的相關性研究

RAS基因家族包括HRAS、KRAS、NRAS，人類表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）級聯(lián)反應與KRAS基因突變相關[38]。BRAF基因是KRAS基因的下游作用因子，同屬RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路[39]。CIMP-1類結直腸癌主要與BRAF基因突變相關（通常為BRAF V600E）。CIMP-2類結直腸癌主要與KRAS基因突變相關[40]。KRAS和BRAF基因突變互相排斥的關系在肺癌中也有類似的報道[41]。

宋敏等[42]研究表明KRAS基因突變與結直腸癌患者的年齡、發(fā)病部位及肝轉移有關，BRAF基因突變與性別、分化程度、腫瘤TNM分期有關。與腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、淋巴結轉移、脈管浸潤等臨床病理特征無相關性。

二、BRAF V600E突變結直腸癌的治療

1.有關針對BRAF基因及下游作用因子的靶向治療

近年來，隨著精準醫(yī)療的發(fā)展，靶向治療已經(jīng)成為治療結直腸癌的有效手段。目前EGFR基因是臨床上治療結直腸癌的主要靶點之一，但由于BRAF基因突變，導致出現(xiàn)抗EGFR藥物抵抗。EGFR靶向抑制劑帕尼單抗和西妥昔單抗對于BRAF V600E突變型結直腸癌患者治療效果差，且預后不良，中位生存期僅為6～9個月[43]。而BRAF V600E突變型黑色素瘤患者對靶向抑制BRAF或聯(lián)合其下游效應器MEK抑制劑治療效果明顯，可獲得高達80%的有效率[44-45]。BRAF突變型的黑色素瘤對BRAF抑制劑維羅非尼的有效率為60%[46]。而轉移性BRAF突變型結直腸癌患者的臨床研究顯示，維羅非尼單藥治療時無臨床獲益[47]。研究發(fā)現(xiàn)與結直腸癌相比，黑色素瘤細胞不是上皮細胞，通常不表達表皮生長因子。BRAF V600E結直腸癌對單藥BRAF抑制缺乏應答，被推測至少部分原因是EGFR的反饋激活導致MAPK信號通路重新激活。

BRAF突變結直腸癌的應答需要強有力的MAPK通路抑制，Corcoran等[48]研究發(fā)現(xiàn)，雙重MAPK通路阻斷BRAF抑制劑達拉法尼和MEK抑制劑曲米替尼可以導致BRAF突變結直腸癌患者的臨床獲益。盡管其他信號通路可能在本病中發(fā)揮重要作用，但這些數(shù)據(jù)表明，有效抑制MAPK信號通路在BRAF突變的結直腸癌中是至關重要的，需要能夠實現(xiàn)更好的MAPK抑制的治療策略。Kopetz等[49]研究表明：BRAF V600E抑制劑聯(lián)合伊立替康及西妥昔單抗治療相較單純使用伊立替康聯(lián)合西妥昔單抗治療的無進展生存時間有顯著的延長，由2個月提高至4.4個月。Kopetz等[50]研究發(fā)現(xiàn)將三聯(lián)體方案與雙聯(lián)體方案進行比較的總體存活率分析，顯示三聯(lián)體方案的死亡率風險比為0.79。不良事件發(fā)生率三聯(lián)療法組與雙聯(lián)療法組相似，3級及以上毒副作用發(fā)生頻率對照組略高于兩組。作為三聯(lián)療法的一部分，比尼梅替尼的加入增加了一些與MEK抑制相關的附加毒性作用。三組和雙組的停藥率和相對劑量強度相似。雖然三聯(lián)治療具有BRAF V600E突變的轉移性結直腸癌患者，其總體生存期明顯長于標準治療。但BRAF V600E突變的結直腸癌的治療還需進一步研究。

2.BRAF突變晚期結直腸癌的免疫治療

目前的研究結果表明，MSI狀態(tài)下的結直腸癌預后較好。Le等[51]的研究表明MSI狀態(tài)可以指導患者進行免疫治療，即PD-1抑制劑可以明顯改善MSI-H狀態(tài)患者的預后。程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）抑制劑納武單抗（nivolumab）現(xiàn)已被美國FDA批準應用于各類表現(xiàn)為MSI-H的惡性腫瘤。BRAF-mt結直腸癌患者中約20%患者同時存在MSI-H表型，這部分患者或許能從抗PD-1/PDL1治療中受益。

三、總結與展望

BRAF V600E突變是結直腸癌發(fā)生發(fā)展扮演重要的角色，雖然目前聯(lián)合治療對結直腸癌BRAF V600E突變有一定效果，但仍會出現(xiàn)耐藥情況，基于BRAF V600E突變在結直腸癌靶向治療的重要性，我們?nèi)孕枭钊胙芯緽RAF基因及MAPK通路，改進腫瘤靶向治療方案，降低結直腸癌的死亡率。