玉海玲 閉德武 覃慧芳 磨立達 羅曉璐

WHO 2017年全球結(jié)核病報告顯示，我國結(jié)核病年發(fā)病率64/100000，每年新發(fā)病例895000例，結(jié)核病總?cè)藬?shù)繼印度之后為全球第2位?？焖僭\斷結(jié)核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）感染，使結(jié)核病早發(fā)現(xiàn)、早治療，可以有效減少結(jié)核病的傳播，對結(jié)核病的防治起到重要的作用。近年來，隨著HIV感染人數(shù)的增多、免疫抑制劑的應用、慢性病的長期用藥等原因，導致機會性非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）的感染人數(shù)增多。NTM感染與MTBC感染的癥狀、肺部X線影像以及全身中毒癥狀、局部表現(xiàn)、臨床表現(xiàn)非常相似，使得臨床難以區(qū)分。且NTM對抗結(jié)核藥物大多呈天然耐藥，故抗結(jié)核藥治療效果不佳，反而對患者機體造成不必要的損傷。因此，在分枝桿菌培養(yǎng)陽性后，盡快做分枝桿菌鑒定，以明確結(jié)核分枝桿菌復合群和/或非結(jié)核分枝桿菌的感染尤為重要。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2018年7月至11月在本院門診就診和住院的294例結(jié)核病患者的分枝桿菌分離株。將菌株制備成10-2和10-4麥氏濃度的懸濁菌液，接種于硝基苯甲酸（PNB）鑒別培養(yǎng)基上，置37℃生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)28d，觀察菌株在PNB培養(yǎng)基上的生長情況；同時利用免疫膠體金試劑盒（凱必利）分別檢測分離株的MPB64特異蛋白抗原，將兩種方法的鑒定結(jié)果進行比較。分離株的最終鑒定結(jié)果以基因芯片法的分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果作為比對標準。

1.2 儀器與試劑 37℃恒溫生化培養(yǎng)溫箱（上海森信試驗儀器有限公司）；PNB培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；MPB64結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒凱必利（杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司）；GeneAtlasTM芯片系統(tǒng)及配套試劑（博奧生物集團有限公司）

1.3 試驗原理方法 （1）PNB的檢測原理：98%～100%的結(jié)核分枝桿菌復合群在含500μg/ml PNB的羅氏培養(yǎng)基上不能生長，而非結(jié)核分枝桿菌中除個別種的少量菌株外，均能耐受500μg/ml的PNB，在固體培養(yǎng)基上生長良好［1］。（2）菌液的制備：在內(nèi)有玻璃珠的無菌小瓶中加入0.2ml生理鹽水，挑取羅氏培養(yǎng)基上適量菌落置于生理鹽水小瓶內(nèi)，擰緊蓋子，于漩渦振蕩器研磨，將研磨過的菌株制成1麥氏單位懸濁菌液備用。制備10-2麥氏濃度懸濁菌液。（3）PNB 培養(yǎng)基法：在生物安全柜內(nèi)，取制備好的10-2懸濁菌液100μl均勻接種于PNB培養(yǎng)基上，置37℃恒溫生化培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)28d，觀察PNB培養(yǎng)基中有無分枝桿菌生長，PNB上有分枝桿菌生長即為非結(jié)核分枝桿菌，PNB上無分枝桿菌生長即為結(jié)核分枝桿菌復合群。（4）MPB64檢測原理：檢測板條的加樣區(qū)內(nèi)含固化的膠體金標記的結(jié)核分枝桿菌復合群培養(yǎng)物濾液蛋白64（MPB64）的單克隆抗體A，被檢測線（T）中有固化的結(jié)核分枝桿菌復合群培養(yǎng)物濾液蛋白64（MPB64）的單克隆抗體B，質(zhì)控線（C）處有固化的鼠IgG多克隆抗體C。當樣品在加樣區(qū)滴下后，若樣品中含有相應的MPB64抗原（D），樣品中的特異蛋白抗原MPB64和抗體A形成A-D免疫復合物，免疫復合物A-D因毛細層析現(xiàn)象移動至檢測線（T）處，被檢測線（T）中固化的結(jié)核分枝桿菌復合群培養(yǎng)物濾液蛋白64（MPB64）單克隆抗體B捕獲，形成A-D-B復合物，并在檢測線（T）處因膠體金的作用形成紫紅色的條帶，這種紫紅色的條帶可以肉眼查看并確定，從而判斷樣品中是否存在待檢的特異蛋白抗原MPB64。若樣品中不含結(jié)核分枝桿菌復合群特異蛋白抗原MPB64（D）時，樣品在加樣區(qū)滴下后不能形成MPB64抗原-抗體A-D復合物，并于檢測線（T）處將無法形成紫紅色條帶。無論樣本中是否有抗原MPB64存在，膠體金標記抗體A因毛細現(xiàn)象繼續(xù)向前移動，在質(zhì)控線（C）處被固化的抗體C捕獲，形成A-C復合物，并在此形成紫紅色條帶，這顯示了膠體金標記的抗體A在檢測板內(nèi)的正常移動。結(jié)果判讀：檢測線（T）和質(zhì)控線（C）均出現(xiàn)紫紅色條帶判斷為陽性；檢測線（T）未出現(xiàn)紫紅色條帶，只有質(zhì)控線（C）出現(xiàn)紫紅色條帶判斷為陰性；若質(zhì)控線（T）未出現(xiàn)條帶需重新檢測。（5）MPB64結(jié)核分枝桿菌抗原檢測：在生物安全柜內(nèi)，將制備好的1麥氏懸濁菌液吸取100μl加入MPB64結(jié)核分枝桿菌檢測板條的檢測區(qū)，15min觀察檢測板條的顯色情況讀取結(jié)果。結(jié)果判讀：檢測線（T）和質(zhì)控線（C）均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性；檢測線（T）未出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線（C）出現(xiàn)紫紅色條帶為陰性；質(zhì)控線（C）未出現(xiàn)條帶需重新檢測。（6）鑒定：294例分離菌株送廣西疾病預防控制中心結(jié)核病防治所，以晶芯基因芯片法做分枝桿菌鑒定。

2 結(jié)果

PNB鑒定培養(yǎng)基結(jié)果：無細菌生長271例為陰性，鑒定為MTBC；有細菌生長23例為陽性，鑒定為NTM。MPB64抗原膠體金法結(jié)果：陽性269例，鑒定為MTBC；陰性25例，鑒定為NTM。晶芯基因芯片法結(jié)果：MTBC 270例，NTM 24例。PNB鑒定培養(yǎng)基生長試驗和MPB64抗原膠體金檢測兩種方法的符合率為99.32%（292/294）。PNB生長試驗對分枝桿菌復合群的檢出率、靈敏度、特異度分別為92.18%（271/294）、99.63%（270/271）、95.83%（23/24）；MPB64膠 體 金抗原檢測法對分枝桿菌復合群的檢出率、靈敏度、特異度分別為 91.50%（269/294）、99.63%（269/270）、100%（24/24），兩種鑒定方法的結(jié)果經(jīng)配對四格表資料的χ2檢驗，統(tǒng)計學處理后χ2=0.091，P=0.763，兩種鑒定方法的檢測結(jié)果比較無顯著性差異。

3 討論

一直以來，對PNB選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)法以其簡單、廉價、相對可靠而得以在全球廣泛應用。目前，我國大部分的醫(yī)療機構(gòu)還是以傳統(tǒng)的PNB培養(yǎng)基培養(yǎng)法對MTBC和NTM進行初步鑒定。該方法是將一定濃度的分枝桿菌菌液接種于500μg/ml對PNB培養(yǎng)基上，置37℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)28d，然后觀察菌株在PNB上的生長情況，依據(jù)生長情況將分枝桿菌初步鑒定為MTBC和NTM。這種傳統(tǒng)的PNB分枝桿菌菌種鑒定，雖然結(jié)果相對可靠，但由于用時太長，難以滿足臨床對快速診治并控制結(jié)核病傳播的需要。因此，臨床迫切需要快速、便捷的MTBC和NTM鑒別方法。MPB64是結(jié)核分枝桿菌復合群在培養(yǎng)生長繁殖過程中分泌到細胞外的一種特異性蛋白質(zhì)，可以用來鑒別結(jié)核分枝桿菌復合群和非結(jié)核分枝桿菌。凱必利試劑盒利用膠體金免疫技術(shù)檢測MPB64，其操作簡便，耗時短，只需15min便能獲得準確結(jié)果。

MPB64是結(jié)核分枝桿菌復合群在培養(yǎng)生長繁殖過程中分泌至細胞外的特異性蛋白質(zhì)，約占培養(yǎng)濾液中分蛋白總量的8%，相對分子量為2.4×104。MPB64蛋白抗原為結(jié)核菌復合群包括人結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌以及牛結(jié)核分枝桿菌BCG亞種和非洲結(jié)核分枝桿菌特異性的分泌蛋白質(zhì)。其是在牛結(jié)核菌弱毒株BCG中的培養(yǎng)液中首次分離得到，而在非結(jié)核分枝桿菌中不形成 MPB64［2-3］。自1984年以來，MPB64即被認定為是MTBC特異性分泌蛋白，故MPB64可以用來區(qū)分MTBC和NTM。迄今為止，PNB生長試驗仍是國內(nèi)大部分結(jié)核病實驗室用于鑒別MTBC和NTM的常規(guī)方法，雖然結(jié)果相對可靠，但其明顯的缺點是耗時太長，出結(jié)果需要28d。MPB64 抗原膠體金法是利用膠體金的檢測技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌分泌的特異性分泌蛋白 MPB64，只需要15min就能獲得結(jié)果。這樣在培養(yǎng)結(jié)果報告的當天即可同時作出分枝桿菌鑒定結(jié)果，較傳統(tǒng)PNB培養(yǎng)法提前了28d。本資料將MPB64膠體金法與傳統(tǒng)的 PNB 生長實驗做比較，以基因芯片法分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果作為比對標準。對294例樣本檢測顯示，MPB64 抗原膠體金法結(jié)果與PNB生長實驗符合率高達99.32%，兩者對于臨床常見分離菌株的MTBC和NTM鑒定無明顯差異（P＞0.05）。兩者靈敏度一樣（99.63%），但MPB64 抗原膠體金法特異度高于PBN培養(yǎng)法，MPB64膠體金法特異度達到100%。這和國外學者的報道是一致的。Kumar、Nakamura等［4-5］對MPT64抗原檢測的研究，均得到100%的特異性。國內(nèi)多篇文獻報道MPT64抗原檢測的特異性均是100%。劉忠華等［6］報道MPT64在臨床分離株中ELISA檢測靈敏度為97.3%，的特異度為100%。韓敏等［7］MPT64對結(jié)核分枝桿菌檢測的靈敏度為98.9%，NTM、真菌、細菌的特異度為100%。

本次研究傳統(tǒng)PNB培養(yǎng)法有1例菌株不生長，導致錯誤鑒定為MTBC。PNB生長試驗陽性對NTM有肯定意義，但陰性沒有否定意義。即在PNB上生長確定為NTM，而在PNB上不生長不一定不是NTM，因為部分NTM在PNB上也不生長。李國利等［8］曾對316株臨床分枝桿菌分離株進行PNB生長試驗，52株MTB菌株均為陰性，264株NTM 菌株中有31株（12%）為陰性。并非所有在PNB上不生長的分枝桿菌一定是MTBC。1例MPB64檢測假陰性結(jié)果可能的原因：（1）結(jié)核分枝桿菌中BCG的幾個亞株（Copenhagen株，Glaxo株，Pasteur株，Tice株）不產(chǎn)生 MPB64 蛋白［9］；（2）一些結(jié)核分枝桿菌分離株發(fā)生mpt 64編碼基因的突變，產(chǎn)生TGA終止碼，部分C末端區(qū)域缺失所致［10］。

綜上所述，MPB64抗原膠體金法與PBN法靈敏度無差異，而特異度MPB64 抗原膠體金法優(yōu)于PNB培養(yǎng)法，并且MPB64 抗原膠體金法操作更簡便，并在15min內(nèi)獲得可靠結(jié)果，可以在培養(yǎng)結(jié)果報陽的當天一起獲得鑒定結(jié)果，可作為結(jié)核分枝桿菌快速鑒別的有效方法之一。肺結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌肺病的用藥治療方案相差較大，NTM對抗結(jié)核藥物大多呈天然耐藥。羅氏培養(yǎng)聯(lián)合特異性蛋白MPB64膠體金檢測，可以在培養(yǎng)結(jié)果報陽的當天即可作出MTBC和NTM的初步鑒定，利于臨床明確診斷和盡快確定治療方向，減少臨床醫(yī)生因無鑒定結(jié)果而盲目經(jīng)驗用藥，這對控制結(jié)核至關(guān)重要。且MPB64膠體金檢測特異性好，確診速度快，操作簡便，值得在各級結(jié)核病實驗室推廣。