朱曉玥，黃敏文，趙述強，張 玫，時 樂，袁耀佐**

1 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210019；2 國家藥品監(jiān)督管理局化學藥品雜質譜研究重點實驗室，南京210019；3 南京中醫(yī)藥大學，南京 210023

硫酸新霉素為氨基糖苷類抗生素，能有效抑制革蘭陰性菌，為國內外臨床上常用的抗生素之一[1]。硫酸新霉素是從新霉素鏈霉菌的代謝產物中分離得到的混合物，主要成分為新霉素B 和C，以及少量新霉素A。新霉胺為硫酸新霉素產品的主要非活性雜質，而巴龍霉素和核糖霉素作為工藝雜質在新霉素中也有檢出[2]。硫酸新霉素有耳毒性和腎毒性，對人體健康危害較大。因此，在硫酸新霉素國家評價性抽驗過程中，按照雜質譜控制（impurity profiles）理念“針對藥品中的每一個雜質，依據(jù)其生理活性制定相應的質控限度”[3]，先建立用于硫酸新霉素雜質譜的膜抑制LC-MS 方法，推定其他主要雜質，共檢出12 個雜質（另文發(fā)表），然后采用不同模型，考察硫酸新霉素及主要相關物質的抗菌活性及毒性差異，為質量標準中的雜質控制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗材料

1.1 儀器與試藥

比濁儀（Densichek plus，生物梅里埃公司）；電子天平（XS205，梅特勒）；聽力檢測系統(tǒng)（TDT auditory systems，Tucker Davis Technologies Incorporated，Gainesville，F(xiàn)L，USA，軟件為powere Sig Gen32 software）；DP2-BSW 熒光顯微鏡（Olympus 公司）。

對照品：硫酸新霉素（批號130309-201512）、硫酸巴龍霉素（批號130371-200305）、硫酸核糖霉素（批 號130348-9301）、新霉胺（批 號130411-200908）均購自中國食品藥品檢定研究院；硫酸新霉素B（批號180803，純度66.007%）、硫酸新霉素C（批號180801，純度60.776%）均為宜昌三峽制藥有限公司提供。水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MHA，批號20180606）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（MHB，批 號20180605）均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 菌株

大腸桿菌（ATCC25922，批號E0006B）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923，批號A0246B）均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 動物

健康SPF 級成年豚鼠（南京江寧青龍山動物繁殖場，生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0011）；斑馬魚胚胎以野生成魚交配獲得（國家斑馬魚資源中心）。

2 方法與結果

2.1 硫酸新霉素及相關物質體外抗菌活性考察

2.1.1 常量肉湯稀釋法 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準[4]，以硫酸新霉素為例：取32支無菌試管，分大腸桿菌組和金黃色葡萄球菌組，編號為1～16，各試管中供試品溶液的濃度（以主藥計）依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5、0.003 906 25 μg·mL-1。將供試菌分別先用MHB 培養(yǎng)基校正菌體濃度至0.5 麥氏比濁度，再用MHB 肉湯稀釋100倍至受試菌濃度約為5×105CFU/mL。另取兩管分別為陽性對照（不添加藥物只添加菌體）和陰性對照（只添加培養(yǎng)基，不添加藥物及菌體）。在1 至16 管和陽性對照管內分別加入受試菌1 mL，混合均勻。將接種好的試管封口置37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察無明顯渾濁管及其相鄰澄清管所對應的藥物濃度，即為最低抑菌濃度（MIC）區(qū)間。結果見表1。硫酸新霉素及相關物質對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性強弱順序均為：硫酸新霉素B＞硫酸新霉素＞硫酸新霉素C＞硫酸核糖霉素＞巴龍霉素＞新霉胺。

表1 各受試藥物最低抑菌濃度（MIC）

2.1.2 紙片擴散法 結合CLSI 推薦的紙片擴散法[5]及用2015 年版《中國藥典》四部抗生素微生物檢定法（通則1201）進行抑菌效果檢測。分別將硫酸新霉素及相關物質用MHB 肉湯配制成1.024 mg·mL-1的供試品溶液（均以主藥計）。精取上述供試品溶液2 μL 分別浸潤藥敏紙片并晾干，將晾干后的各藥敏紙片放于含有敏感細菌的固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18 h，測定抑菌圈直徑大?。ㄈ鐖D1）。硫酸新霉素及相關物質對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌體外抗菌活性強弱順序均為：硫酸新霉素B＞硫酸新霉素＞硫酸新霉素C＞硫酸核糖霉素＞巴龍霉素＞新霉胺，與常量肉湯稀釋法的結果吻合。

2.2 硫酸新霉素及成分B、C 對豚鼠聽力損傷考察

圖1 各供試品溶液的體外抗菌活性直觀對比圖（紙片擴散法）

選體重250～350 g 雄性豚鼠，適應性飼養(yǎng)3 天，隨機分為空白組、硫酸新霉素組、硫酸新霉素B 組（下稱B 組）、硫酸新霉素C 組（下稱C 組）。各組每天分別腹腔注射，劑量為：硫酸新霉素組100mg·kg-1，B 組80mg·kg-1，C 組15mg·kg-1；給藥體積均為5mL·kg-1；空白組給予等體積的生理鹽水。各組常規(guī)飲食，避免其他聽力損傷因素的干擾，連續(xù)給藥28天。末次給藥后第2 天，受試動物顱頂正中皮下為正極，給聲側耳廓后下為負極，接地電極于鼻翼。發(fā)出300 Hz 為主的短聲刺激信號，間隔90ms，帶通濾波50～3000Hz，疊加200 次，掃描時程20 ms。聲刺激強度從90 Db SPL 開始，以5 Db 逐次遞減，觀察Ⅰ波以判定兩側耳的ABR 聽閾值。結果顯示，與空白組比較，硫酸新霉素組和B 組ABR 聽閾值明顯升高，有顯著性差異（P＜0.01）；與空白組比較，C 組聽閾值未見明顯升高（P＞0.05）。與硫酸新霉素組比較，B 組ABR 聽閾值低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；C 組ABR聽閾值顯著低于硫酸新霉素組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 硫酸新霉素及成分B、C 對豚鼠ABR 聽閾的影響

2.3 硫酸新霉素及成分B、C 對斑馬魚的毒性考察

2.3.1 斑馬魚藥物致死率研究 取成熟斑馬魚，黑暗10 h、照明14 h 條件下飼養(yǎng)，產卵時按雌雄1∶1 放入交配魚缸，獲取受精卵。實驗挑選健康受精卵于6孔板中（試驗前24 h 停止喂食）。實驗分組同“2.2”項。給藥的3 個組給予系列濃度受試藥物，空白組加入小魚培養(yǎng)液。斑馬魚暴露給藥后每天以同樣濃度藥液換液1/2，分別在24、48、72 h 時間點觀察斑馬魚反應及存活情況。結果顯示，在100～250μg·mL-1濃度范圍內，硫酸新霉素組與B 組在48 h 全部死亡；C組只有在濃度250 μg·mL-1下48 h 出現(xiàn)死亡，其他濃度72 h 才出現(xiàn)死亡。由于給藥3 天后幼魚基本死亡，故以72 h 為觀察終點。用χ2檢驗（Fisher 精確概率法）對比各給藥組給藥72 h 后的累積死亡率，結果顯示，硫酸新霉素組的毒性與B 組相比，無顯著差異，兩組毒性均明顯高于C 組（P＜0.001，P＜0.001）。

2.3.2 斑馬魚器官毒性研究 實驗分組同“2.2”項。取成熟斑馬魚，光照交替培養(yǎng)，產卵后選取健康胚胎，按每組給予30 枚胚胎，置于0.5、0.2、0.1 μg·mL-1不同濃度的試驗藥物中，每天更換藥液1 次。胚胎發(fā)育至72 h 時，將測試液替換為人工海水，胚胎發(fā)育至第7 天時進行毛細胞染色，在熒光顯微鏡下觀察毛細胞形態(tài)并拍攝。毛細胞染色結果顯示，0.5 μg·mL-1劑量的硫酸新霉素組和B 組即可對毛細胞產生較大破壞（毛細胞數(shù)量較少），而C 組各劑量對毛細胞影響不大。見圖3。

圖3 斑馬魚毛細胞染色結果 注：熒光點代表毛細胞

3 討論

3.1 體外抑菌活性的研究

常量肉湯稀釋法和紙片擴散法為經典的體外抗菌活性測定方法，具有操作簡單、定性結果肉眼可見、無需特殊儀器判定等優(yōu)勢。本研究采用上述兩種方法研究了硫酸新霉素及成分B、C，新霉胺、核糖霉素及巴龍霉素的體外抗菌活性，獲得了它們的抗菌效果信息并相互驗證了它們的抗菌活性的強弱順序。作為硫酸新霉素主要雜質的新霉胺抗菌作用較弱，采用微生物檢定法按照平均裝量計算硫酸新霉素含量時會產生較大偏差，提示應該控制新霉胺的含量。而成分B、C 抗菌效果與硫酸新霉素略有差別，臨床應用過程中應重點關注各自不良反應，合理使用抗生素并作個體化治療。

3.2 動物模型的毒性研究

氨基糖苷類抗生素的嚴重副作用為耳毒性，毛細胞為感受聲波刺激的感覺上皮細胞，ABR 的Ⅰ波起源于與毛細胞相連接的聽神經樹突的突觸后電位，毛細胞的損傷會引起ABR 的Ⅰ波的變化[6]，因此ABR 是檢測聽覺系統(tǒng)損傷較為敏感的方法。在硫酸新霉素中，其成分B 約占80%，成分C 約占15%[7]，本次實驗為客觀評估B、C 在硫酸新霉素引起的耳毒性中所帶來影響的大小，故按照此比例設定劑量。結果顯示，C 組ABR 聽閾值與空白組相當，硫酸新霉素組和B 組ABR 聽閾值明顯升高。有理由推測，成分B 是引起硫酸新霉素耳毒性副作用的主要因素。

斑馬魚因具有與哺乳動物相似的生物結構及生理功能而被廣泛用于毒理學研究[8]。結合藥物致斑馬魚死亡率和器官毒性的結果，3 種物質的毒性排序為硫酸新霉素＞B＞C，與豚鼠聽力損傷的研究結果一致，由此可進一步推測成分B 是硫酸新霉素中的主要毒性所在，而成分C 的毒性較弱。

3.3 對質量標準提高的一些思考

綜合體外抗菌活性及毒性實驗的結果，表明新霉胺抑菌作用較弱，成分C 的毒性與空白組相當，成分B 比硫酸新霉素毒性較低，提示可能存在其他毒性雜質。EP9.0 版采用HPLC-PAD 法測定硫酸新霉素的有關物質并明確了相關雜質限度[9]。2015 年版《中國藥典》僅采用薄層色譜法對硫酸新霉素原藥中的新霉胺控制限度[10]，與國外藥典比較存在較大差距。隨著雜質譜控制理念廣泛應用于新藥研發(fā)，結合硫酸新霉素有關物質測定的相關文獻報道的啟示，建議在硫酸新霉素質量標準中增加對有關物質的控制，明確新霉素C、新霉胺、單雜及總雜的限度，提高該藥質量。