青島海關(guān) （山東，青島，266071）

冠狀病毒（Coronavirus，CoV）是一類嚴(yán)重危害人類和畜禽健康的致病微生物，普遍存在于自然界中，自然宿主包括人、牛、豬、犬、禽、貓、蝙蝠、鼠等，廣泛宿主特點(diǎn)和自身基因組結(jié)構(gòu)使其演變過程中較易發(fā)生基因變化，呈現(xiàn)基因遺傳多樣性，新冠狀病毒和亞型不斷出現(xiàn)[1]。目前已知能感染人的冠狀病毒共7種，分別為20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒 229E（HCoV-229E）[2]和 OC43（HCoV-OC43）[3]，2003年新出現(xiàn)的SARS冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome virus，SARS-CoV）[4]，2004 年發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒 NL63 （HCoV-NL63）[5]，2005 年新發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒香港 I（HCoV-HKU1）[6]，2012 年在中東地區(qū)出現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERSCoV）[7]，2020 在武漢出現(xiàn)的新型冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）[8]。

核酸擴(kuò)增技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域非常有效的技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如常規(guī)培養(yǎng)、血清學(xué)和免疫學(xué)方法等均存在局限性[9]。自上世紀(jì)90年代起，科研人員發(fā)展了十多種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （loop mediated isothermal amplification，LAMP）[10]， 核酸序列依賴的擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA）[11]， 重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）[12]，重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（recombinase aid amplification，RAA）[13]，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）[14]，鏈替代擴(kuò)增（strand displace ment amplification，SDA）[15]，依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增技術(shù) （helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）[16]等。 本文著重介紹LAMP 技術(shù)在檢測(cè)人冠狀病毒的研究進(jìn)展。

1 LAMP基本原理

LAMP是Notomi等于2000年提出來的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物（內(nèi)引物和外引物各2條），利用擁有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下快速、高效、高特異的擴(kuò)增目的序列，包括啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴(kuò)增階段、伸長和再循環(huán)階段等幾個(gè)階段。LAMP基本原理是DNA變性后在Bst DNA聚合酶作用下內(nèi)外引物不斷延伸，內(nèi)引物延伸產(chǎn)物被外引物延伸產(chǎn)物置換出來，形成啞鈴狀DNA，再進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，不斷延伸和擴(kuò)增，最終形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯示不同大小區(qū)帶的階梯式圖譜[9]。

2 LAMP技術(shù)特點(diǎn)

LAMP技術(shù)是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，LAMP的主要特點(diǎn)是[17]：

靈敏度和特異性高：檢出限僅為幾個(gè)拷貝，與PCR相比高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。利用外引物和內(nèi)引物與目的片段6個(gè)特異性部位準(zhǔn)確結(jié)合發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，只有當(dāng)2對(duì)引物與目的片段6個(gè)區(qū)域都匹配時(shí)才進(jìn)行擴(kuò)增。LAMP擴(kuò)增結(jié)果只有是和否，相比于PCR具有更高特異性。

檢測(cè)速度快、擴(kuò)增效率高：LAMP是恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，無需預(yù)先熱變性雙鏈DNA，避過PCR退火、復(fù)性過程，避免溫度循環(huán)而造成的時(shí)間損失，能夠滿足臨床樣本的快速檢測(cè)需要。60-90分鐘內(nèi)完成基本反應(yīng)并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，加入環(huán)引物后，可在30-45分鐘內(nèi)完成反應(yīng)。通過鏈取代并形成不同環(huán)結(jié)構(gòu)而大量擴(kuò)增，促使目的基因在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)連續(xù)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，拷貝數(shù)可達(dá)109-1010，濃度可達(dá)0.5mg/mL，高于PCR 103-104倍。

設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便：由LAMP反應(yīng)只需要如水浴鍋、金屬浴等恒溫器即可完成此實(shí)驗(yàn)，不需要購置昂貴的PCR儀，易于推廣應(yīng)用。除Bst DNA聚合酶必須在模板預(yù)變性以后再加樣外，其他與PCR基本相同；由于反應(yīng)溫度恒定，反應(yīng)后通過判斷顏色變化而無需電泳。

產(chǎn)物易檢測(cè)：根據(jù)LAMP反應(yīng)特性，判斷產(chǎn)物結(jié)果的方法有瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法、濁度檢測(cè)法和熒光比色檢測(cè)法等。LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生多種片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其在電泳中會(huì)形成特異性的梯狀條帶，此為電泳檢測(cè)法。由于LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)是否形成白色沉淀來定性判斷結(jié)果，此為濁度檢測(cè)法。通過SYBR GreenⅠ、鈣黃綠素（Calcein）熒光染料的顏色變化來定性判斷靶序列擴(kuò)增與否，陽性為綠色，陰性為橙色，此為熒光比色檢測(cè)法。另外，通過實(shí)時(shí)濁度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)過程中焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生的濁度實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

3 LAMP在檢測(cè)人冠狀病毒中的應(yīng)用

目前，LAMP已廣泛應(yīng)用于食品分析、生物安全、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原微生物的快速檢測(cè)，尤其在病毒方面的快速檢測(cè)發(fā)展迅速，可對(duì)多種病毒進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，成為前景廣闊的快速診斷手段。而國內(nèi)外也有研究將LAMP應(yīng)用于人冠狀病毒的檢測(cè)，多采用濁度檢測(cè)法和熒光比色檢測(cè)法來判定結(jié)果。

3.1 LAMP在檢測(cè)MERS-CoV中的應(yīng)用

LAMP在MERS-CoV檢測(cè)中多采用N基因作為靶基因，其次為開放閱讀框架 （Open reading framework，ORF）和包膜蛋白（envelope protein，E）基因，且方法特異性較高，未發(fā)現(xiàn)與其他呼吸道病原體發(fā)生相關(guān)的交叉反應(yīng)。

關(guān)麗等建立了基于濁度儀和羥基萘酚藍(lán)（Hydroxy naphthol blue，HNB）顏色變化的簡(jiǎn)單、快速和靈敏的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）方法應(yīng)用于MERS-CoV檢測(cè)，對(duì)于每反應(yīng)管拷貝數(shù)RNA，出峰時(shí)間與每反應(yīng)管核衣殼蛋白 （nucleocapsid protein sequence，N）基因103-106的RNA拷貝對(duì)數(shù)值有穩(wěn)定線性關(guān)系，基于濁度儀和顏色判定的RTLAMP檢測(cè)限分別為500和1000拷貝[18]。趙娜等建立了基于N基因檢測(cè)MERS-CoV的RT-LAMP方法可檢測(cè)到為 1-100 拷貝/反應(yīng)（25 μL），并篩選出高特異性引物，安全、便捷、快速且高通量。體系中只需加入模板并結(jié)合配套儀器，耗時(shí)不超過45分鐘，對(duì)口岸等人員流動(dòng)性大的地區(qū)疑似患者進(jìn)行快速篩查，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[19]。Shirato等利用基于N基因的RT-LAMP方法可檢測(cè)到3.4個(gè)拷貝的MERS-CoV RNA，且與其他呼吸道病毒無交叉反應(yīng)，該法的靈敏度與實(shí)時(shí)RT-PCR法相似[20]。Li等利用基于RT-LAMP檢測(cè)MERS-CoV，使用識(shí)別N基因的6個(gè)引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增。產(chǎn)物通過LA-320c環(huán)放大器濁度計(jì)（實(shí)時(shí)RT-LAMP）檢測(cè)或通過預(yù)先添加羥基萘酚藍(lán)（可視RT-LAMP）目視檢查顏色變化。通過對(duì)幾種人冠狀病毒和常見呼吸道病毒的檢測(cè)驗(yàn)證RT-LAMP的特異性。MERS-CoV實(shí)時(shí)RTLAMP在 10 （3）-10 （6） 拷貝的線性相關(guān) （R2）為0.995。實(shí)時(shí)RT-LAMP、可視RT-LAMP和定量實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)限分別為 500、1000 和 100 拷貝/反應(yīng)[21]。Lee等建立了基于one-pot RT-LAMP的高效、快速、高特異性檢測(cè)MERS-CoV的方法。利用N基因設(shè)計(jì)了一套 LAMP 引物 （F3、B3、FIP、BIP、Loop-F 和Loop-B），優(yōu)化了 RT-LAMP酶條件：100 U M-MLV RTase和4 U Bst聚合酶，該反應(yīng)能夠在60分鐘內(nèi)檢測(cè)到4個(gè)MERS-CoV感染性病毒基因組拷貝。EvaGreen染料在one-pot RT-LAMP反應(yīng)中具有更好的信號(hào)讀出特性，并且比SYBR green I更適合DNA聚合酶。利用可現(xiàn)場(chǎng)部署的微腔裝置進(jìn)一步評(píng)估了等溫?cái)U(kuò)增的特異性N基因，與其他急性呼吸道疾病病毒包括H1N1和H3N2、乙型流感、HCoV-229E，以及人偏肺病毒沒有交叉反應(yīng)[22]。 Huang 等建立了一種結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫化技術(shù)和垂直流動(dòng)顯示條（RT-LAMP-VF）檢測(cè)MERS-CoV N基因的可視化技術(shù)，該法可檢測(cè)20拷貝/μL的合成RNA轉(zhuǎn)錄物和10拷貝/μL的MERS-CoV RNA，并且與 SARS 相關(guān)冠狀病毒、HKU4、HKU1、OC43 和229E等多種冠狀病毒無交叉反應(yīng)。與實(shí)時(shí)RT-PCR方法相比，該法操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的設(shè)備，可在35分鐘內(nèi)快速完成檢測(cè)[23]。Shirato等基于專門用于監(jiān)測(cè)引物衍生信號(hào)的淬火探針建立quenching Probe RT-LAMP（QProbe-RT-LAMP）方法檢測(cè)MERSCoV。兩個(gè)引物集（靶向N基因和ORF1a序列）均能檢測(cè)到與現(xiàn)有基因診斷方法相同水平的MERSCoV RNA，與其他呼吸道病毒沒有交叉反應(yīng)。這些引物集可高效擴(kuò)增來自不同MERS-CoV株（包括駱駝MERS-CoV株）的靶序列。此外，該法檢測(cè)效果與沙特阿拉伯患者臨床標(biāo)本的實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)效果相當(dāng)[24]。Bhadra等建立了非對(duì)稱五引物 RTLAMP方法檢測(cè)MERS-CoV，擴(kuò)增位于ORF1a和ORF1b基因以及E基因上游的基因位點(diǎn)。另外，為LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)時(shí)序列特異的證實(shí)，添加了一步鏈置換探針（OSD）。通過在每個(gè)試驗(yàn)中加入一個(gè)單環(huán)引物，不對(duì)稱擴(kuò)增加速了OSD-RT-LAMP結(jié)果。30-50分鐘內(nèi)，在感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可以檢測(cè)到 0.02-0.2 PFU（5-50 PFU/mL）的 MERS-CoV，并且與普通人呼吸道病原體沒有交叉反應(yīng)[25]。

3.2 LAMP在檢測(cè)SARS-CoV和其他人冠狀病毒中的應(yīng)用

呂恒等建立了基于SARS-CoV ORF1b保守區(qū)域的LAMP可視化法，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用顏色指示劑Calcein判定反應(yīng)結(jié)果，使LAMP的結(jié)果判斷更簡(jiǎn)單直觀，為疫情現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、反生物恐怖檢測(cè)等提供快速可視化的檢測(cè)方法。本方法最低檢出限約為10拷貝/反應(yīng)管，高于普通PCR；檢測(cè)特異性高，僅SARS-CoV反應(yīng)管Calcein顏色由褐色變?yōu)辄S綠色，而甲型H1N1病毒、高致病性H5亞型禽流感病毒、普通流感病毒均不發(fā)生變色反應(yīng)；體系的擴(kuò)增效率高于普通PCR，35分鐘內(nèi)出結(jié)果[26]。Hong等建立了一種基于ORF1b復(fù)制酶基因快速檢測(cè)SARS-CoV的單管快速實(shí)時(shí)定量RT-LAMP方法，與常規(guī)RTPCR比較，靈敏度提高100倍，檢測(cè)限為0.01 PFU，檢測(cè)臨床標(biāo)本中病毒RNA的敏感性和特異性分別為100%和87%。通過限制性內(nèi)切酶切分析和擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列分析進(jìn)一步驗(yàn)證了RT-LAMP分析的特異性。根據(jù)RT-LAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線和陽性時(shí)間測(cè)定，大多數(shù)臨床標(biāo)本的病毒濃度為0.1 PFU。分析過程非常簡(jiǎn)單，在單管中進(jìn)行擴(kuò)增，不到1小時(shí)（最早11分鐘）內(nèi)即可得結(jié)果[27]。Poon等將實(shí)時(shí)LAMP方法檢測(cè)SARS-CoV與定量PCR方法進(jìn)行比較，兩種方法都沒有產(chǎn)生假陽性結(jié)果。對(duì)發(fā)病前3天內(nèi)分離的樣本，定量PCR檢測(cè)率 （14/15為陽性）高于LAMP檢測(cè)（9/15為陽性）；對(duì)3天以上疾病患者樣本的檢測(cè)率相似 （PCR檢測(cè)44例中32例陽性，LAMP檢測(cè)44例中33例陽性）[28]。耿合員等利用基于顏色判定的RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HCoV-NL63 N基因，在擴(kuò)增前加入Calcein作為反應(yīng)指示劑，并結(jié)合濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以最終反應(yīng)顏色變化作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，該法在40分鐘可達(dá)到對(duì)HCoVNL63的檢測(cè)，并且與加入同種屬其他人冠狀病毒、諾如病毒、流感病毒RNA模板溶液顏色均不產(chǎn)生改變，檢測(cè)特異性較高。最低檢測(cè)下限為1600拷貝/反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)HCoV-NL63現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有在國境口岸以及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疫區(qū)現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用的潛力[29]。Pyrc等利用基于N基因的LAMP方法檢測(cè)HCoV-NL63 RNA，發(fā)現(xiàn)該方法的特異性較好，與其他呼吸道病毒無交叉反應(yīng)。在細(xì)胞培養(yǎng)上清和臨床樣本中的檢測(cè)限為1個(gè)拷貝/反應(yīng)[30]。耿合員等利用基于顏色判定的RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HCoVOC43 N基因，在擴(kuò)增前加入Calcein作為反應(yīng)指示劑，以最終反應(yīng)顏色變化作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。選定的1組特異性引物使HCoV-OC43 RNA產(chǎn)生特異性反應(yīng)并出現(xiàn)顏色改變，而與甲型、乙型流感病毒和其他HCoV均不能，具有較高的特異性。與常規(guī)熒光定量RT-PCR 法相比，靈敏度達(dá) 5.6 拷貝/反應(yīng)[31]。劉勝牙等建立了檢測(cè)HCoV-HKU1的LAMP，設(shè)計(jì)5套LAMP擴(kuò)增引物，以合成的HCoV-HKU1質(zhì)粒為模板，通過實(shí)時(shí)濁度法進(jìn)行最佳引物組的篩選，發(fā)現(xiàn)HCoV-HKU1 LAMP對(duì)其他病原微生物和人類基因組無反應(yīng)信號(hào)。該方法可以檢測(cè)到1拷貝/μL的HCoV-HKU1質(zhì)粒。HCoV-HKU1 LAMP擴(kuò)增方法特異性好、靈敏度高[32]。

4 展望

LAMP技術(shù)是一種近些年發(fā)展起來的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，具有靈敏度和特異性高、檢測(cè)速度快、擴(kuò)增效率高、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)物易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，比較適用于基層醫(yī)療和檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)。已有多種LAMP試劑盒實(shí)現(xiàn)商業(yè)化和國產(chǎn)化，檢測(cè)成本進(jìn)一步降低，促進(jìn)了LAMP技術(shù)的發(fā)展。但也有一些不足，如需購置熒光定量PCR儀或濁度儀、擴(kuò)增對(duì)引物要求高、篩引物工作量繁重、開蓋容易造成氣溶膠污染等，因而需要采取必要措施解決不足之處。截止到目前為止，在檢測(cè)人冠狀病毒核酸方面，已有檢測(cè)HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV 和 MERSCoV核酸方面的研究，但未有研究顯示LAMP技術(shù)應(yīng)用HCoV-229E和新型冠狀病毒核酸的檢測(cè)。將來在現(xiàn)今研究的基礎(chǔ)上，補(bǔ)足LAMP在檢測(cè)人冠狀病毒方面的缺失，同時(shí)聯(lián)合其他技術(shù)方法進(jìn)一步對(duì)LAMP擴(kuò)增過程進(jìn)行優(yōu)化，建立起更加有效的檢測(cè)方法并逐步推廣到臨床。