(貴州省關(guān)嶺布依族苗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 關(guān)嶺 561300)

關(guān)嶺牛是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的78個(gè)地方畜禽品種之一，主要分布于貴州省安順市和黔南布依族苗族自治州的19個(gè)縣，其中關(guān)嶺縣為主產(chǎn)區(qū)并因此得名。血液原蟲是牛最常見的寄生蟲之一，常見的有附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)、泰勒蟲(Theileria)、巴貝斯蟲(Babesia)、伊氏錐蟲(Trypanosoma)等[1]。大多數(shù)血液原蟲病通過吸血昆蟲傳播，而關(guān)嶺縣溫潤(rùn)多雨的氣候特點(diǎn)也增加了牛感染血液原蟲的概率。2017年8—10月，關(guān)嶺縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心對(duì)轄區(qū)內(nèi)的關(guān)嶺牛進(jìn)行附紅細(xì)胞體感染情況流行病學(xué)調(diào)查，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1抽檢血樣：按7%的存欄比例采集關(guān)嶺縣12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)的關(guān)嶺牛血液。

1.1.2主要試劑：2×TaqMaster Mix試劑(康為世紀(jì)生物科技有限公司)、瓊脂糖(Amresco)、DL 2 000 DNA Marker(TaKaRa)、GoldView核酸染料(Solarbio)、無水乙醇(天津福晨化學(xué)試劑廠)、ddH2O、天根DP318-02血液基因組DNA提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1牛附紅細(xì)胞體基因組DNA提取，引物設(shè)計(jì)：根據(jù)天根DP318-02血液基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行牛附紅細(xì)胞體基因組DNA提取。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛附紅細(xì)胞體序列，登錄號(hào)為AY946266的16S核糖體RNA基因部分序列設(shè)計(jì)引物，目的序列長(zhǎng)度為833 bp。

1.2.2PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系采用25 μL反應(yīng)體系，其中2×TaqMaster Mix 13.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 10 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)，再延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存；同時(shí)設(shè)立未加DNA模板的等體積陰性對(duì)照。取PCR產(chǎn)物6 μL，小心加樣于10 g/L TBE瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，以相同體積的DL 2 000 DNA Marker作對(duì)照進(jìn)行電泳，設(shè)定電泳條件為100 V，電泳時(shí)間30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，準(zhǔn)確記錄陽(yáng)性樣品，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并計(jì)算感染率。感染率(%)=感染樣品數(shù)/采集樣品數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 牛附紅細(xì)胞體PCR擴(kuò)增結(jié)果由圖1可見：檢測(cè)的陽(yáng)性樣品目的條帶為833 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序后得到821 bp的序列片段，擴(kuò)增后測(cè)得的序列經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)后顯示與牛附紅細(xì)胞體同源性達(dá)到99%。說明設(shè)計(jì)的引物可以準(zhǔn)確鑒定牛附紅細(xì)胞體。

2.2 感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果由表1可見：12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中有6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的關(guān)嶺牛感染了附紅細(xì)胞體，其中坡貢鎮(zhèn)養(yǎng)殖牛感染率最高為30%，新鋪鎮(zhèn)養(yǎng)殖牛感染率最低為6.67%，總體平均感染率為5.73%。

圖1 牛附紅細(xì)胞體PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DL 2 000 DNA Marker；1、3：檢測(cè)陽(yáng)性樣品；2：檢測(cè)陰性樣品

表1 關(guān)嶺縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)殖的關(guān)嶺牛附紅細(xì)胞體感染情況統(tǒng)計(jì)

3 小結(jié)

調(diào)查結(jié)果顯示，牛附紅細(xì)胞體已成為我縣關(guān)嶺牛的1種較為常見的寄生蟲病，有50%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛場(chǎng)存在附紅細(xì)胞體感染，雖然牛群總體平均感染率不高，只有5.73%，但對(duì)我縣養(yǎng)牛業(yè)具有潛在的威脅，各地養(yǎng)牛場(chǎng)應(yīng)高度重視并做好防治工作。(1)在蜱、疥螨等外寄生蟲高發(fā)的季節(jié)(7—10月)要進(jìn)行滅蜱和疥螨工作，減少傳播媒介[2]。(2)飼養(yǎng)圈舍要建設(shè)在通風(fēng)良好的較高地段，保持圈舍干燥。(3)對(duì)圈舍要勤打掃，勤消毒，糞便要及時(shí)無害化處理。(4)藥物治療：目前常用并且效果較好的抗附紅細(xì)胞體藥物是貝尼爾(又名血蟲凈)[3]，可按照5 mg/kg 體重按說明書方法給藥。