(山東醫(yī)學高等?？茖W校，山東 臨沂 276000)

自2000年人白介素-21(Interleukin-21，IL21)被發(fā)現以來，其生物學作用越來越受重視。研究發(fā)現：IL21是生物調控網絡中重要的一類細胞因子，其生物學作用非常復雜，既能夠促進機體免疫應答，也可抑制機體免疫應答，同時對免疫應答也能起到調節(jié)作用；同時，IL21對T、B、NK以及單核巨噬細胞的激活和調控也可以起到關鍵的作用，是人體固有性免疫應答和適應性免疫應答的關鍵細胞因子。

殼聚糖及甲殼素在濃堿中脫去乙?；傻玫侥軌蛉苡谒嵝运芤旱木郯被咸烟荹1]，是一種天然陽離子性多糖化合物，具有安全、惰性、溶解速度快等優(yōu)點，可作片劑、微丸劑、硬膠囊劑的藥物包衣[2]，具有良好的生物吸收性和相容性，來源豐富、價格低、安全無毒，可以保護外源基因免遭細胞內溶酶體的破壞，有利于提高外源基因在細胞內的表達[3]。

本研究利用快速膜乳化-熱固化聯合的方法[4]制備IL21 DNA核酸疫苗，制備粒徑均一可控的殼聚糖季銨鹽凝膠微球，檢測其對脂多糖誘導小鼠巨噬細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Balb/c小鼠(山東大學實驗動物中心提供)，DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清(Gibco)， 脂多糖(Sigma)，CCK-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)，殼聚糖、羥丙基三甲基氯化銨等其他試劑均為國產分析純。

1.2IL21微球的制備 處死小鼠，提取其淋巴細胞總RNA，逆轉錄得cDNA。根據IL21序列(Genebank)設計引物，引物Ⅰ(EcoR I)：5’-TAGCTCTGTCGCCTGGAGACTCAGTTCTG-3’，引物Ⅱ(XhoⅠ)： 5’-CCGGGATATCCTAGGAGAGATGCTGATG-3’。PCR反應體系為：94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，40次循環(huán)后72℃延伸10 min。擴增獲得IL21基因片段，用于制備真核表達重組體pcDNA3.1(+)-IL21；利用烴丙基三甲基氯化銨對殼聚糖進行修飾，制備得到季銨化的殼聚糖；利用快速膜乳化技術與熱固化法相結合，制備殼聚糖季銨鹽凝膠微球。

1.3腹腔巨噬細胞培養(yǎng)及實驗分組 先在小鼠腹腔注射5 ml1640培養(yǎng)液，輕揉腹部后處死小鼠，打開腹腔，抽取腹腔液，離心棄上清液，含小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸后置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，培養(yǎng)液充分洗滌，棄去未貼壁細胞，加入含1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。取巨噬細胞(5×104個/孔)接種于96孔板，共27孔，分3組(每組9孔)，分別加PBS磷酸鹽緩沖液(空白對照組)、1μg/ml脂多糖(陽性對照組)、20μg/mlIL21微球與1μg/ml脂多糖(共同作用組)。其中上清液用于一氧化氮的測定，細胞用于活化caspase-3 檢測。

1.4一氧化氮的測定 三組分別取100μl培養(yǎng)上清液與等體積Griess試劑混合，避光，振蕩反應10 min后，酶標儀測量OD490nm，每組測3孔，計算平均數。

1.5活化 caspase-3 檢測 各組提取巨噬細胞總RNA，通過逆轉錄獲得cDNA。Caspase-3：5’-TGACCGAGGCTACATTCAGATGACACC-3’(上游)；5’-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3’(下游)。β-actin：5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3’(上游)：5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’(下游)。反應體系為94℃ 10 min，30個循環(huán)(94℃ 50 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min)，72℃ 8 min。經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像系統(tǒng)計算與β-actin光密度值相對表達量。每組測3孔，計算平均數。

1.6細胞增殖率的計算 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS充分洗滌后，調整至相同細胞數(1×105個細胞/ml)，三組再培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后，用酶標儀于450 nm波長下測定吸光度A，每組取3孔平均數，計算細胞增殖率=[(A實驗組-A對照組) /A對照組×100%]。

2 結果

2.1IL21微球的制備情況 制備獲得pcDNA3.1(-)-IL21質粒核酸疫苗，經 EcoR I和XhoⅠ雙酶切電泳鑒定。見圖1。

圖1 IL21微球鑒定電泳圖

2.2IL21微球疫苗對增殖活性的影響 陽性對照組細胞增值率為(88.86±2.31)%，共同作用組為(49.50±6.34)%。兩組比較有統(tǒng)計學意義(t=10.10，P<0.01)。

2.3IL21微球對一氧化氮釋放的影響 Griess法檢測表明，空白對照組、陽性對照組、共同作用組一氧化氮的釋放量依次為(8.67±4.26)、(27.67±3.76)、(15.33±2.33)μmol/l。三組比較有統(tǒng)計學意義(F=22.18，P=0.002)，兩兩比較顯示，陽性對照組高于共同作用組及空白對照組(q=6.03，9.28；P<0.05)，共同作用組與空白對照組之間無統(tǒng)計學意義(q=3.25，P>0.05)。

2.4IL21微球對caspase-3的影響 陽性對照組為(1.121±0.058)，共同作用組為(0.717±0.074)，兩組比較有統(tǒng)計學意義(t=7.44，P=0.002)。

3 討論

IL21為γ鏈家族細胞子成員之一，被認為是調節(jié)性細胞因子，能促進機體由非特異性免疫向特異性免疫的轉變[5]。單核-巨噬細胞起源于骨髓造血干細胞，能夠在機體免疫防御中發(fā)揮重要作用，具有廣泛的生物學功能，能觸發(fā)固有免疫應答，啟動適應性免疫應答，包括嗜菌作用、促炎作用[6-7]。本研究通過PCR技術，體外擴增得到IL21，制備pcDNA3.1(-)-IL21核酸疫苗，經瓊脂糖凝膠電泳得出，其目的基因片段為490 nm，與預計大小一致。利用快速膜乳化-熱固化聯合的方法制備IL21 DNA核酸疫苗。微球疫苗與小鼠巨噬細胞分組共同培養(yǎng)后，通過其對與巨噬細胞免疫效應的影響，考察微球疫苗對小鼠免疫應答的作用，研究結論：培養(yǎng)24 h后，與磷酸鹽緩沖液空白對照組相比，脂多糖刺激陽性對照組細胞的凋亡明顯增加，一氧化氮的釋放和caspase-3的活化明顯增強。

本課題組成功構建了殼聚糖季銨鹽凝膠微球疫苗，可有效提高吞噬細胞殺傷功能，本研究的順利開展為腫瘤疫苗的后續(xù)研究提供了思路和理論依據。