李昱櫻，申?duì)顮?，榮二花，鄭赟，吳玉香

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉花屬雙子葉植物(Dicotyledons)、錦葵科(Malvaceae)、棉屬(Gossypium)。目前有51個(gè)種，其中46個(gè)為二倍體棉種(2n=2X=26)，5個(gè)為異源四倍體棉種(2n=4X=52)[1]。草棉(G.herbaceumL.)是二倍體，屬于A染色體組栽培棉。又名阿拉伯棉、小棉，也稱非洲棉。長期以來在棉屬四倍體棉種起源的問題上，研究者普遍認(rèn)為草棉和亞洲棉是四倍體棉種A基因組的祖先供體種[2]。草棉雖然對(duì)現(xiàn)代紡織工業(yè)貢獻(xiàn)不大，但與異源四倍體棉花A基因組密切相關(guān)，為異源四倍體棉花提供了纖維性狀，草棉本身也具有其它棉花品種所沒有的優(yōu)良性狀[3]，如極早熟性、抗角斑病等，因而草棉在AD組棉花進(jìn)化過程中起著十分重要的作用。同時(shí)，A組亞洲棉和D組雷蒙德氏棉全基因組測序的完成[4,5]，也為AD組棉種間種質(zhì)互滲及異源四倍體進(jìn)化的研究提供了更大的空間。

多倍化是物種形成的重要方式，蘊(yùn)藏著豐富的遺傳變異的潛力，多倍體生物不僅有很強(qiáng)的活力，還有很多性狀都優(yōu)于其二倍體親本[6]。多倍體研究對(duì)了解物種的起源和進(jìn)化有十分重要意義，通常棉屬被作為研究多倍體進(jìn)化的模式植物，通過人工遠(yuǎn)緣雜交或加倍，可以為研究早期基因組互作和進(jìn)化提供理論依據(jù)。

近年來通過陸地棉和斯特提棉的遠(yuǎn)緣雜交和染色體加倍，成功獲得了染色體組完整的異源六倍體植株[7]；以草棉做母本,雷蒙德氏棉做父本進(jìn)行的遠(yuǎn)緣雜交也成功獲得草雷雜種[8]；也曾對(duì)亞洲棉[9]和草棉[10]進(jìn)行過多倍體誘變。但草棉獲得的突變型未能結(jié)鈴，因此本研究在前期嘗試和研究的基礎(chǔ)上，采用改良后的初生分生組織處理法重新誘導(dǎo)草棉二倍體，旨在將二倍體草棉加倍成同源四倍體，獲得能夠結(jié)鈴并且育性穩(wěn)定的同源四倍體，這對(duì)于棉花的種質(zhì)創(chuàng)新和下一步遠(yuǎn)緣雜交遺傳育種具有重要意義。

1 材料和方法

1. 1 試驗(yàn)材料

本研究所用材料為紅星草棉(GossypiumherbaceumL.)(2n=2x=26)，來源于國家種質(zhì)三亞野生棉圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多倍體誘變

本試驗(yàn)選用0.2%的秋水仙堿瓊脂凝膠涂抹幼苗生長點(diǎn)48 h的方法，具體步驟如下：⑴用60 ℃溫水將棉花種子浸種并不斷攪拌，水溫下降到40 ℃以下后靜置浸泡48 h，待種子露白后，將其撈出并包裹在濕潤的紗布中，待胚根伸長至2～3 cm后用鑷子將種皮剝離并繼續(xù)保持在濕潤的環(huán)境中，待子葉展開后將幼苗移栽到裝有營養(yǎng)液的小瓶中；⑵在幼苗露出生長點(diǎn)后，將0.2%的秋水仙堿瓊脂糖凝膠涂抹在幼苗生長點(diǎn)上保持48 h，誘變結(jié)束后用清水將凝膠沖洗干凈；⑶在幼苗生長點(diǎn)恢復(fù)生長或長出1～2片真葉后，將幼苗移栽到營養(yǎng)缽中，一周左右后轉(zhuǎn)移至溫室花盆中，待幼苗生長穩(wěn)定并且室外氣溫適宜后可搬至室外，定期澆水管理及性狀觀察。

1.2.2 突變型形態(tài)學(xué)鑒定

觀察誘變植株和對(duì)照植株苗期的生長狀況，依據(jù)生長受阻、葉色濃綠、葉片皺縮、植株畸形等指標(biāo)對(duì)得到的誘變株進(jìn)行初步篩選和鑒定。在棉花生長進(jìn)入花期后，選取野生型和誘變株各5株，每株棉花各選取倒三葉和倒十葉之間5片無病蟲害且生長健康的葉片，測量葉長、葉寬,計(jì)算葉面積和葉形指數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 流式細(xì)胞儀倍性檢測

具體步驟如下：(1)取新鮮待測葉片0.5 cm2，置于培養(yǎng)皿中。(2)用刀片將葉片切碎，加入400 μL的裂解液，來提取完整的細(xì)胞核。(3)將其用30 μm濾網(wǎng)過濾至樣品管中。(4)將1 600 μL染液加入樣品中。(5)上機(jī)測試。

1.2.4 細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

⑴氣孔保衛(wèi)細(xì)胞觀察：取新鮮的棉花葉片洗凈，切取主葉脈附近1 cm×2 cm，浸泡在卡諾氏固定液(無水乙醇∶氯仿∶冰乙酸=5∶3∶2)中；待葉片完全脫色后，用蒸餾水將葉片清洗干凈，然后切取約2 mm×2 mm的葉片置于載玻片上，下表皮朝上，加一滴1%的I2-KI溶液，染色10 min，在顯微鏡下觀察；在10×40倍的視野下，統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)量；在顯微鏡10×100倍的視野下，測量氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(2)有絲分裂觀察：采取根尖有絲分裂制片法，將收獲的飽滿的種子，60 ℃溫水浸種24～48 h，將其撈出包裹在濕潤的紗布中，每日清水洗滌兩次；待種子根長長至1 cm，剪取根尖放入適量的飽和對(duì)二氯苯溶液中，室溫下預(yù)處理3～4 h；用蒸餾水清洗3遍，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液中固定，室溫過夜；用蒸餾水清洗3次，放于1 mol·L-1HCl中解離3 h，用蒸餾水清洗3次，轉(zhuǎn)入蒸餾水中漂洗過夜；然后將其置于裝有卡寶品紅的小瓶子中，染色過夜；用刀片切取1～1.5 mm于干凈載玻片上，蓋上蓋破片，壓片；置于顯微鏡下觀察，選取并統(tǒng)計(jì)50個(gè)以上的染色體分散良好細(xì)胞照相并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草棉突變型和野生型形態(tài)特征比較

對(duì)所獲得的突變型進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)判斷，選取形態(tài)性狀符合多倍體的突變型5株進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。突變型生長受阻，葉片顏色濃綠，且葉片皺縮、增厚；莖干較野生型粗。對(duì)5株突變型和野生型的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示突變型葉片變大，野生型和突變型的葉長、葉寬存在極顯著差異；二者的葉長X葉寬值、葉形指數(shù)存在顯著差異(表1)。突變型葉長與野生型葉長相比變化幅度為+25.25%，突變型葉寬與野生型葉寬相比變化幅度為+30.31%，突變型葉長X葉寬值與野生型葉長X葉寬值相比變化幅度為+36.55%，突變型葉形指數(shù)與野生型葉形指數(shù)相比變化幅度為-3.89%，結(jié)果表明突變型的誘變效果明顯，初步形態(tài)學(xué)特征表明突變型為多倍體。

表1突變型和野生型的形態(tài)學(xué)指數(shù)差異

Table1 Morphological indices variation of mutants and wild type

材料Material葉長/cmLeaf length葉寬/cmLeaf width葉長×葉寬/cm2Leaf length×Leaf width葉形指數(shù)Leaf index突變型4.79±0.966.28±1.2131.03±11.30.76±0.07野生型3.82±0.754.82±0.8522.73±7.490.8±0.08變化幅度+25.25%+30.31%+36.55%-3.89%P value0.0015 0.0001 0.0137 0.1753

2.2 流式細(xì)胞儀倍性檢測

根據(jù)對(duì)突變型的初步形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，采用流式細(xì)胞儀對(duì)5株突變型進(jìn)行倍性檢測(圖1)，結(jié)果顯示野生型的峰值在200，而突變型5的峰值在400，突變型1、3、4的峰值在380，突變型2的峰值在420，表明5株突變型的DNA含量接近野生型DNA含量的二倍。流式細(xì)胞倍性檢測結(jié)果表明，所測植株中有1株為四倍體植株，其余4株為非整倍體植株。

圖1 突變型和野生型流式細(xì)胞倍性檢測結(jié)果Fig.1 Flow cytometry results for ploidy level between mutants and wild type

2.3 葉片下表皮氣孔性狀的鑒定結(jié)果

對(duì)突變型和野生型的葉片下表皮氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞長度進(jìn)行觀察并測量，統(tǒng)計(jì)分析50個(gè)清晰的視野，結(jié)果表明突變型和野生型的氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞長度存在顯著差異，且隨著倍性提高，突變型氣孔密度比野生型降低25.29%，突變型保衛(wèi)細(xì)胞比野生型長度增加32.86%，結(jié)果進(jìn)一步證明突變型為四倍體植株(表2)。

表2突變型和野生型的氣孔性狀的差異

Table2 Difference of Stomatal characters between mutants and wild type

材料Material氣孔密度Stomatal density保衛(wèi)細(xì)胞長/μmGuard cell length突變型33.27±5.33.34±0.41野生型44.47±5.182.52±0.26變化幅度-25.29%+32.86%

2.4 突變型細(xì)胞學(xué)鑒定(染色體)

判斷植物染色體倍性最具說服力的標(biāo)準(zhǔn)是染色體數(shù)目的變化。根據(jù)對(duì)突變型的流式細(xì)胞倍性鑒定結(jié)果，將四倍體突變型5的種子單獨(dú)收獲，并對(duì)所收獲的種子進(jìn)行根尖有絲分裂染色體鑒定，選取50個(gè)以上的染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)(圖2)，結(jié)果表明所有二倍體草棉根尖染色體數(shù)目均為2n=2x=26，而其突變型經(jīng)鑒定染色體數(shù)目均為2n=4x=52(圖 2)，本研究細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明突變型的染色體數(shù)為對(duì)照的2倍,即為同源四倍體。

圖2 突變型和野生型有絲分裂中期染色體數(shù)比較Fig.2 Chromosomes at Metaphase of mitosis between mutants and wild type(left is mutant and right is wild type)

3 討論與結(jié)論

3.1 多倍體鑒定方法探討

關(guān)于如何鑒定多倍體，長期以來一直是遠(yuǎn)多倍體育種工作者十分關(guān)注的熱點(diǎn)問題，目前已知鑒定的方法有若干種，但效果和優(yōu)缺點(diǎn)各不同。采用形態(tài)學(xué)鑒定不夠準(zhǔn)確，需要用其它方法進(jìn)一步驗(yàn)證。流式細(xì)胞結(jié)果易分析，但所需要的費(fèi)用比較昂貴。染色體計(jì)數(shù)是最直觀的鑒定倍性的方法，也可以區(qū)分非整倍體或染色體的缺失或增多等，但花費(fèi)時(shí)間比較長。袁素霞等通過根尖有絲分裂方法鑒定了甘藍(lán)類蔬菜的倍性[11]；郭計(jì)華等通過流式細(xì)胞技術(shù)鑒定了香蕉的倍性[12]。本試驗(yàn)使用形態(tài)學(xué)、根尖有絲分裂染色體數(shù)、葉片下表皮氣孔密度和長度,以及流式細(xì)胞技術(shù)等方法綜合對(duì)突變型進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明突變型有1株為同源四倍體，4株為非整倍體植株，突變型的其它性狀及其育性還在進(jìn)一步觀察和研究中。

3.2 人工誘導(dǎo)多倍體方法的選擇

長期以來，有各種各樣誘導(dǎo)多倍體的方法，但目前主要采用物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法[13]。物理法是用溫度、離心力等各種物理方法對(duì)染色體進(jìn)行加倍，但由于效率低且不穩(wěn)定而未普遍使用?；瘜W(xué)方法因其成本低，操作簡單而被廣泛使用。目前最常用的方法是使用秋水仙堿等化學(xué)誘變劑進(jìn)行誘變。秋水仙堿是從百合科秋水仙植物中提取出來的，是一種劇毒的有機(jī)化合物[14]。1937年，隨著秋水仙堿的加倍效果被發(fā)現(xiàn)，作用于組織分裂最旺盛的部分，成為使用最廣泛的的誘變劑之一[15,16]。生物學(xué)方法盡管取得了一些成效，但存在一些缺點(diǎn)，如費(fèi)用昂貴，成活率低，要想獲得理想材料，仍然需要進(jìn)一步研究。

很久以來育種工作者就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了多倍體的重要性。植物染色體加倍的同時(shí)，會(huì)使多倍體植株生長緩慢，導(dǎo)致生育期推遲，這對(duì)于觀賞性的花卉具有重要意義，也會(huì)增強(qiáng)植株的抗逆性。而且植物多倍體能豐富遺傳基礎(chǔ)，在棉花育種中發(fā)揮重要作用。此外，通過多倍體進(jìn)行早期基因組進(jìn)化機(jī)制研究也得到了廣泛關(guān)注[17]。

本研究采用秋水仙堿誘導(dǎo)初生分生組織的方法對(duì)草棉進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，結(jié)果表明5株誘變株和野生型形態(tài)性狀差異顯著，進(jìn)一步分析鑒定表明，有1株為同源四倍體，并且能夠獲得飽滿種子，且育性穩(wěn)定，其余4株為非整倍體植株，后續(xù)觀察和研究還在進(jìn)行中。