劉春鳳,張麗婷,李小林,施 鎮(zhèn),張子龍,李 健,陳 田?,邱 璐?

(1.上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135; 2.上海家化聯(lián)合股份有限公司啟初研究中心,上海 200082; 3.上海國際旅行衛(wèi)生保健中心,上海 200335)

由皮膚過敏引起的過敏性皮炎占皮膚相關(guān)疾病的15%～20%[1],因此對接觸皮膚的化學(xué)品及化妝品進(jìn)行過敏性測試是安全性評價(jià)的重要項(xiàng)目。 現(xiàn)在大部分皮膚致敏測試仍然依賴于動物測試,小鼠局部淋巴結(jié)檢測(LLNA)作為一種替代方法,以淋巴結(jié)的T細(xì)胞增殖定量測定代替皮膚臨床癥狀觀察[2],可以減少實(shí)驗(yàn)動物的使用量,可取代傳統(tǒng)動物實(shí)驗(yàn)：豚鼠的經(jīng)典方法、幾內(nèi)亞豬最大化試驗(yàn)(GPMT)和Buehler試驗(yàn)(OECD TG 406),但沒有實(shí)現(xiàn)完全替代。 隨著2013 年歐盟相關(guān)法規(guī)實(shí)驗(yàn)動物禁令的推行[3-5],樣品檢測對體外方法的需求越來越多。

致敏檢測體外方法的研發(fā)基于有害結(jié)局路徑(Adverse Outcome Pathway,AOP)的概念,將皮膚致敏的過程分為四個關(guān)鍵事件,基于每一個關(guān)鍵事件的分子起始事件都有對應(yīng)的體外測試方法被開發(fā),有些已被列入世界經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織(OECD)測試指南TG442,如直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)(direct peptide reactivity assay,DPRA)[6]、ARE-Nrf2 熒光素酶方法[7]、人細(xì)胞系活化實(shí)驗(yàn)(human cell line activation test, h-CLAT)[8]等。

ARE-Nrf2(antioxidant responsive element-NF-E2-related factor 2)熒光素酶方法是針對角質(zhì)形成細(xì)胞的活化的關(guān)鍵事件建立的體外替代方法,目前OECD 收錄的有KeratinoSensTM以及LuSens。 它的原理是：Keap1-Nrf2-ARE 信號通路可以通過控制抗氧化酶或者蛋白的表達(dá)來保護(hù)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激的損傷,該信號通路可以被皮膚致敏物激活。 目前ARE-Nrf2 熒光素酶方法只用于對單一化學(xué)物進(jìn)行檢測。 我國的化妝品監(jiān)管為成品監(jiān)管,因此探索體外的方法在化妝品成品檢測中的應(yīng)用對我們的化妝品檢測有更為重要的意義。 本研究旨在建立ARE-Nrf2 熒光素酶方法,并探索本方法對成品檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級BALB/c 小鼠,雌性,8 ～12 周齡(18 ～22 g),44 只,由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[SCXK(滬) 2018-0004]。 動物實(shí)驗(yàn)在上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心[SYXK(滬) 2014-0020]進(jìn)行,動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件為屏障系統(tǒng)動物房,溫度18℃～22℃,濕度40%～65%,自由飲食,12 h 人工照明。 該實(shí)驗(yàn)研究由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)( IACUC 號：SHCIQAFTC-M015),并遵照動物實(shí)驗(yàn)3R 原則在飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中給予了恰當(dāng)?shù)娜说狸P(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞

人永生化表皮細(xì)胞HaCaT 細(xì)胞購于北納生物。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(56℃加熱滅活30 min)、0.25%胰酶/EDTA 溶液(Trypsin/EDTA)、青霉素/鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖液(DPBS)、遺傳霉素G-418、TRIzol plus RNA 純化試劑盒及cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛,美國);二甲基亞砜(DMSO)(西格瑪奧德里奇,美國);熒光素酶檢測試劑盒(珀金埃爾默, 美國);CCK-8 試劑(株式會社同仁化學(xué)研究所,日本);無菌離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(25 cm2、75 cm2培養(yǎng)瓶、96 孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板)(康寧,美國);SRBR Green 染料(海方生物,中國)。 水楊酸(CAS：69-72-7)、乳酸(CAS：50-21-5)、甘油(CAS：56-81-5)、SDS(CAS：151-21-3)、1-丁醇(CAS：71-36-3)、異丙醇(CAS：67-63-0)、肉桂醛(CAS：104-55-2)、二甲基丙烯酸二醇酯(CAS：97-90-5)、肉桂醇(CAS：104-54-1)、2-巰基苯并噻唑(CAS：149-30-4)、4-甲氨基苯酚硫酸鹽(CAS：55-55-0)、2,4-二硝基氯苯(CAS：97-00-7)、對苯醌(CAS：106-51-4)、甲醛(CAS：50-00-0)、間苯二酚(CAS：108-46-3)、芐基溴(CAS：10039-0)均購自Sigma 公司。

待測樣品：某品牌抗菌洗衣液、瞬清亮彩洗衣液、瞬清無磷洗衣液、自制化妝水配方、市售某品牌化妝水、市售化妝水添加50%肉桂醇。

II 級生物安全柜(Labconco,美國);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,美國);熒光讀板機(jī)(Perkin Elmer,美國);全波長酶標(biāo)儀(BioTek,美國);細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Orflo,美國);離心機(jī)(Thermo,美國);細(xì)胞凍存盒(康寧,美國)(Coolcell);倒置顯微鏡(徠卡,德國);PCR 儀(ABI,美國);實(shí)時(shí)定量PCR 儀(ABI,美國);DNA 電泳儀(伯樂,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法

HaCaT 細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株均在含10%胎牛血清(FBS) 的DMEM (Dulbecco’ s modified eagle medium)培養(yǎng)基中于5% CO2,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選

細(xì)胞株的構(gòu)建參見Emter 等人的方法[9],PGL4.17 質(zhì)粒從Promega 購得,在KpnI 和HindIII酶切位點(diǎn)之間插入人工合成的含有人AKR1C2-ARE 和SV40 啟動子的序列5’-GGTACCTGGTCGC AAGGTGTGCAAGCTGCTGAGTCACCCTGACTGCATC AACCCCAGGAGCTAGATCTGCGATCTGCATCTCAAT TAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCC ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCT CCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAG AGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAG AAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTT TGCAAAAAGCTT-3’, 構(gòu) 建 成 功 的 pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40 質(zhì)粒含有熒光素酶基因以及neor基因,可以用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選。 使用Nucleofector 系統(tǒng)(Lonza)用程序U-020 轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞。 使用含有500 μg/mL G-418 的培養(yǎng)基來篩選穩(wěn)定的克隆,分離、擴(kuò)增單克隆細(xì)胞,篩選到的穩(wěn)定生長的克隆進(jìn)行PCR 及熒光素酶鑒定及細(xì)胞凍存。1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及實(shí)時(shí)定量PCR鑒定

熒 光 素 酶 的 引 物 序 列： 正 向 引 物 5’-ACGCACATATCGAGGTGGAC-3’, 反 向 引 物 5’-TGCTTTGGAAGCCCTGGTAG-3’,β 肌動蛋白的引物序列：正向引物5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’,反向引物：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。正常生長的細(xì)胞使用TRIzol 法進(jìn)行RNA 的提取,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,PCR 體系為20 μL,含有4 μL cDNA、4 μL ddH2O、1 μL 正向引物(10 μmol/L)、1 μL反向引物(10 μmol/L)和10 μL 2×Taq mix,放到PCR 中,運(yùn)行以下程序95℃5 min, 95℃15 s,55℃30 s,68℃30 s,后面三步35 個循環(huán),將所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 熒光定量PCR 體系為 20 μL, 含 有 4 μL cDNA、 0.4 μL ROX referencedye2、4.6 μL ddH2O、 0.5 μL 引 物(10 μmol/L)和10 μL SYBR green mix。 均勻地加到96孔板中,每個樣品三個復(fù)孔,將96 孔板放到7500 Fast Real-Time PCR System (ABI)儀器中,運(yùn)行以下程序95℃5 min, 95℃15 s, 60℃1 min,后面兩步40 個循環(huán)。 數(shù)據(jù)通過β 肌動蛋白進(jìn)行歸一化。

1.3.4 受試物暴露

將測試化學(xué)物以200 mmol/L 的濃度溶解在去離子水中,不溶于水的溶于DMSO 中。 將化學(xué)物在溶劑中按2 倍稀釋系數(shù)稀釋8 個濃度,配成100 倍母液。 將DSens 細(xì)胞接種在96 孔板中(100 μL 不含G418 的生長培養(yǎng)基)。 24 h 后,進(jìn)行化學(xué)物暴露,化學(xué)物用含有1% FBS 的100 μL 新鮮培養(yǎng)基稀釋到終濃度,溶劑的最終濃度為1%。 在每個實(shí)驗(yàn)中,在所有8 種濃度下都有6 個復(fù)孔,每個板含有細(xì)胞和溶劑的對照孔。 孵育48 h 后,去除測試化學(xué)物,用DPBS 洗滌細(xì)胞一次,加入100 μL 細(xì)胞裂解液,1 min 后轉(zhuǎn)移到檢測用白板,使用熒光讀板機(jī)進(jìn)行讀數(shù)。 對于細(xì)胞活力測定,孵育48 h 后,去除測試化學(xué)物,用DPBS 洗滌細(xì)胞一次,加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基,向每個孔中加入10 μL CCK8 溶液,溫育1～3 h 后,450 nm 測光吸收。

1.3.5 LLNA：BrdU-ELISA 實(shí)驗(yàn)方法

雌性BALB/c 小鼠隨機(jī)分組,每組4 只小鼠,樣品連續(xù)3 d 涂抹于小鼠雙耳背,第5 天腹腔注射BrdU標(biāo)記液,第6 天摘取小鼠耳部淋巴結(jié),制備淋巴細(xì)胞懸液,采用ELISA 法測定BrdU 摻入細(xì)胞的水平。

1.3.6 結(jié)果分析

(1)誘導(dǎo)倍數(shù)計(jì)算

誘導(dǎo)倍數(shù)(I)= (L 受試物-L 空白)/(L 溶劑-L空白)

式中：

L 受試物—— 受試物熒光讀數(shù);

L 空白—— 空白(不含細(xì)胞不含受試物)熒光讀數(shù);

L 溶劑—— 溶劑對照(陰性對照)熒光讀數(shù)均值。

(2)EC1.5 計(jì)算

EC1.5=(Cb-Ca)×((1.5-Ia)/(Ib-Ia))+Ca

式中：

Ca —— 誘導(dǎo)值大于1.5 時(shí)的受試物最低濃度,μmol/L;

Cb —— 誘導(dǎo)值小于1.5 時(shí)的受試物最高濃度,μmol/L;

La —— 大于1.5 時(shí)受試物最低濃度對應(yīng)的誘導(dǎo)值(平行均值);

Lb —— 小于1.5 時(shí)受試物最高濃度對應(yīng)的誘導(dǎo)值(平行均值)。

(3)細(xì)胞活性計(jì)算

細(xì)胞活性=(V 受試物-V 空白)/(V 溶劑-V 空白)×100

式中：

V 受試物—— 受試物的吸收值;

V 空白—— 空白(不含細(xì)胞不加受試物)的吸收值;

V 溶劑—— 溶劑對照的吸收均值。

(4)ICx 計(jì)算

ICx=(Cb-Ca)×((100-x)-Va)/(Vb-Va)+Ca

式中：

X —— 要計(jì)算的抑制率百分比(%,如IC50 或者IC30)

Ca —— 抑制率大于x%的最低濃度,μmol/L;

Cb —— 抑制率小于x%的最高濃度,μmol/L;

Va —— 抑制率大于x%的最低濃度下的細(xì)胞活率(%);

Vb —— 抑制率小于x%的最高濃度下的細(xì)胞活率(%)。

(5)結(jié)果判斷：

a.對于任何一個結(jié)果的判定都要經(jīng)過至少兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)至少三個平行,如果兩次結(jié)果不一致,則應(yīng)進(jìn)行第三次實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)應(yīng)在不同的時(shí)間,所用受試物必須新鮮配制。

b.陽性結(jié)果的判定：兩次或三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都滿足以下四條,則被預(yù)測為陽性結(jié)果,否則為陰性。

i.受試物的最大誘導(dǎo)倍數(shù)Imax 大于等于1.5,與對照相比有顯著性差異(t-test);

ii.EC1.5 濃度下細(xì)胞的存活率大于70%;

iii.EC1.5 濃度小于1000 μmol/L,或者未確定分子量的受試物小于200 μg/mL;

iv.熒光素酶誘導(dǎo)有明顯的劑量依賴性增加。

如果在給定的重復(fù)中,所有三個第一條件都得到滿足,但不能觀察到熒光素酶誘導(dǎo)的明顯劑量依賴性的增加,那么這種重復(fù)的結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是不確定的,可能需要進(jìn)一步的測試。 此外,在最大試驗(yàn)濃度＜1000 μmol/L (或?qū)ξ创_定分子量的試驗(yàn)化學(xué)品為200 μg/mL)且在最高試驗(yàn)濃度時(shí)細(xì)胞活力＜70%活力的受試物所獲得的陰性結(jié)果也應(yīng)視為非決定性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

皮膚致敏劑可作用于傳感器蛋白Keap1,從而使其與核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 解離,解離的Nrf2 可以激活多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄[10]。 我們通過轉(zhuǎn)染pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40 質(zhì)粒構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,熒光素酶信號反映了內(nèi)源性Nrf2 依賴基因的致敏物激活狀態(tài),此方法可以通過定量檢測由Keap1-Nrf2-ARE 反應(yīng)通路激活引起的熒光素酶基因表達(dá)情況,作為皮膚致敏的反應(yīng)量化指標(biāo)。本研究是基于OECD TG 442D 測試指南進(jìn)行[7],但是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是由我們自己構(gòu)建,因此需要進(jìn)行驗(yàn)證是否與商品化KeratinoSensTM細(xì)胞株有一致的作用條件,以及對指南中的參考物質(zhì)是否具有很好的檢測能力。

2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定

將G-418 篩選出的兩株可以正常生長的細(xì)胞株(標(biāo)記為DSens-1,DSens-2)進(jìn)行PCR 鑒定,如圖1A所示,只有DSens-1 有熒光素酶的表達(dá),而野生型的HaCaT 細(xì)胞跟DSens-2 都是陰性的結(jié)果,因此DSens-1 為陽性細(xì)胞株(以后稱DSens)。 將PCR 鑒定出的陽性穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株DSens 進(jìn)行陽性物質(zhì)肉桂醛(CAS：104-55-2)測試,檢測該細(xì)胞株是否對肉桂醛有劑量效應(yīng)。 結(jié)果表明肉桂醛濃度與熒光素酶的表達(dá)量有明顯的量效關(guān)系(圖1B),表明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建是成功的。

2.2 DSens 實(shí)驗(yàn)條件確定

我們的操作規(guī)程參照了OECD TG 442D 測試指南,但是由于使用的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株發(fā)生了改變,因此需要確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件。 首先進(jìn)行鋪板密度的確認(rèn)：將細(xì)胞以不同的數(shù)量接種到96 孔板(0.0625-6×104個細(xì)胞/孔),使用64 μmol/L 的肉桂醛暴露48 h,檢測肉桂醛的最大誘導(dǎo)倍數(shù),結(jié)果如圖2A 所示,64 μmol/L 肉桂醛的誘導(dǎo)倍數(shù)在接種量大于1×104個細(xì)胞/孔時(shí)在2 ～8 之間,并且,接種量在1×104個細(xì)胞/孔時(shí),誘導(dǎo)倍數(shù)最大,表明在此細(xì)胞密度下檢測的敏感性最高。 這個結(jié)果與KeratinoSensTM的推薦實(shí)驗(yàn)條件是一致的,并且數(shù)值符合KeratinoSensTM可接受的標(biāo)準(zhǔn)。 其次,熒光素酶試劑盒確認(rèn)：我們使用了輝光型的熒光素酶試劑盒而非瞬時(shí)發(fā)光的熒光素酶試劑盒,雖然的熒光衰減隨時(shí)間較為緩慢,但是不清楚是否會對最終的結(jié)果判定產(chǎn)生影響。 為了確定在加入裂解液之后的不同時(shí)間讀取數(shù)值對最終結(jié)果判定的影響,我們對同一樣品進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)讀取,結(jié)果顯示,隨著時(shí)間的延長,樣品的熒光強(qiáng)度會緩慢下降(圖2B),但是對數(shù)據(jù)處理后的EC1.5 影響不大(表1),不會影響到對結(jié)果的判定。

圖1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定Figure 1 Identification of the stably transfected cell line

圖2 細(xì)胞數(shù)量及數(shù)據(jù)讀取時(shí)間對DSens 實(shí)驗(yàn)的影響Figure 2 Effects of DSens cell number and data reading time on the DSens cell experiment

表1 根據(jù)圖2B 的數(shù)據(jù)計(jì)算的肉桂醛的EC1.5Table 1 EC1.5 of cinnamaldehyde calculated according the date in Figure2B

2.3 化學(xué)物樣品檢測

本研究共對16 種化學(xué)物進(jìn)行檢測,包括OECD 指南推薦的10 種化學(xué)物和6 種自選化學(xué)物(表2)。 從結(jié)果可以看出,DSens 對OECD 指南推薦的10 種化學(xué)物的預(yù)測與KeratinoSensTM預(yù)測結(jié)果一致[7],并與LLNA 的結(jié)果相符[11]。 從EC1. 5 的數(shù)值來看,10 種化合物都在OECD 指南的參考范圍內(nèi)。 6 種自選化學(xué)物的結(jié)果也與LLNA 的結(jié)果一致[11],其中SDS 是典型的具有刺激性但無致敏性的物質(zhì),DSens 對其檢測結(jié)果沒有出現(xiàn)假陽性。 KeratinoSensTM對間苯二酚的檢測出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[9],但是DSens 給出了與LLNA 一致的陽性預(yù)測。

2.4 混合物樣品檢測

KeratinoSensTM的方法因?yàn)槿狈游飳?shí)驗(yàn)的驗(yàn)證而不能確定其在混合物檢測中的準(zhǔn)確性,DSens 方法也存在同樣的問題,因此我們在混合物樣品的選取上盡量選擇已知檢測結(jié)果的樣品以便進(jìn)行結(jié)果的驗(yàn)證。 混合物樣品濃度按照未知分子量的物質(zhì)來設(shè)置,最高濃度為200 μg/mL。 洗衣液樣品的LLNA：BrdU-ELISA 的預(yù)測結(jié)果如表3 顯示,樣品組不同濃度組的SI 與對照組相比沒有顯著性差異,預(yù)測結(jié)果為陰性。 表4 結(jié)果顯示：三個洗衣液的樣品暴露的DSens 細(xì)胞中熒光素酶基因的表達(dá)沒有被激活,在設(shè)置的一系列濃度中最大誘導(dǎo)倍數(shù)Imax 沒有大于1.5 的數(shù)值,DSens 預(yù)測為陰性,與LLNA：BrdU-ELISA 的預(yù)測結(jié)果一致(表3);自制化妝水中的肉桂醛是化妝品中可以添加的香料致敏物,但其濃度超過限度可能會引起致敏反應(yīng),DSens 結(jié)果顯示樣品的EC1.5 為(82.43±13.36)μg/mL＜200 μg/mL,預(yù)測為陽性,與DPRA 結(jié)果一致(多肽平均消除率為13.98%)[12];某品牌化妝水在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)最大誘導(dǎo)倍數(shù)Imax 沒有大于1.5 的數(shù)值,預(yù)測為陰性,與人體斑貼試驗(yàn)結(jié)果一致;組合化妝水中添加了50%的肉桂醇,肉桂醇是一種弱致敏物,廣泛應(yīng)用于食品香精及化妝品香精中, DSens 結(jié)果顯示樣品的EC1.5 為(90.52±13.31)μg/mL＜200 μg/mL,預(yù)測為陽性。 總體樣品的檢測結(jié)果顯示,6 種樣品的預(yù)測結(jié)果與已知的結(jié)果一致,預(yù)測成功率100%,并且能夠預(yù)測出過量添加的弱致敏物,說明DSens方法具有對混合物樣品進(jìn)行預(yù)測的潛力,為化妝品成品或者日用化學(xué)品的致敏檢測提供有價(jià)值的參考。

表2 DSens 結(jié)果與KeratinoSensTM及LLNA 結(jié)果比較Table 2 Comparison of results of DSens Prediction, with that of KeratinoSensTM Prediction and LLNA Prediction

表3 洗衣液樣品LLNA：BrdU-ELISA 檢測結(jié)果Table 3 Laundry samples LLNA： BrdU-ELISA test results

表4 混合物樣品DSen 細(xì)胞預(yù)測結(jié)果與其他預(yù)測結(jié)果比較Table 4 Comparison of the prediction results of mixture products obtained by DSens method and the results of other prediction test methods

3 討論

物質(zhì)的致敏性預(yù)測作為最重要的安全性評價(jià)項(xiàng)目之一,對體外方法的需求非常高,但是由于致敏反應(yīng)的復(fù)雜性,單靠一種體外方法難以對物質(zhì)的致敏性進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷,因此多種體外檢測方法的組合運(yùn)用,可以提高檢測的準(zhǔn)確率。 體外檢測方法,尤其是組合方法的運(yùn)用,可以幫助我們找到優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)動物的替代方案,更好的服務(wù)于國內(nèi)的化妝品企業(yè)及原料商。 目前商品化的KeratinoSensTM在國內(nèi)的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化存在諸多困難,DSens 方法是國內(nèi)建立的ARE-Nrf2 熒光素酶方法,它可以彌補(bǔ)國內(nèi)這一方法的空缺,為國內(nèi)的體外致敏檢測方法提供的更多的選擇,也為體外組合方法提供了更多的可能性。

本研究使用OECD TG 442D 測試指南推薦的10 種化學(xué)物對該方法進(jìn)行了成功的驗(yàn)證,這顯示該方法的可靠性,可以作為進(jìn)一步研究和推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。 此外,我們另外選取了6 種化學(xué)物,其結(jié)果與Emter 等[9]人的文章中的數(shù)據(jù)進(jìn)行的比對,發(fā)現(xiàn)DSens 對間苯二酚的檢測結(jié)果為致敏陽性,與人體試驗(yàn)和LLNA 結(jié)果相符,并沒有出現(xiàn)KeratinoSensTM的 假 陰 性 結(jié) 果。 這 也 顯 示 出 DSens 與KeratinoSensTM方法雖然采用了相同的技術(shù)手段,兩者之間也存在細(xì)微的差異。 但這種差異性產(chǎn)生的原因還不清楚,一種可能的原因由于外源基因插入基因組位置的不同導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株存在一定的差異性,這使得Dsens 對酚類物質(zhì)的預(yù)測不會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果,當(dāng)然要證實(shí)這一點(diǎn),我們還需要去驗(yàn)證更多化學(xué)物如丁香酚、二氫丁香酚等,這值得我們?nèi)ミM(jìn)一步的討論和研究。

本研究采用DSens 方法對混合物樣品進(jìn)行致敏性檢測,并與其他檢測方法的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較,取得了一致的結(jié)果,表明了DSens 方法具有用于產(chǎn)品致敏預(yù)測的潛力。 由于我國對產(chǎn)品安全性的監(jiān)控采用成品測試的方法,DSens 對成品的預(yù)測潛力可以為企業(yè)研發(fā)產(chǎn)品測試提供新的可能。 未來將嘗試建立以ARE-Nrf2 熒光素酶方法為基礎(chǔ)的系列體外檢測方法,可用于可溶性混合物成品如：化妝水、乳液、洗護(hù)產(chǎn)品、植物提取物及日用化學(xué)品等樣品檢測。