陳超杰,鐘志鳳,何嘉莉,張水華

(1.梧州學(xué)院,化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院,廣西 梧州 543002; 2.福建醫(yī)科大學(xué),福建省新藥安全性評價中心,福州 350122; 3.陸軍軍醫(yī)大學(xué),高原軍事醫(yī)學(xué)系高原作業(yè)醫(yī)學(xué)教研室,重慶 400038)

焦慮癥(anxiety disorders)是一類以發(fā)作性或持續(xù)性情緒焦慮,并伴有自主神經(jīng)紊亂、肌肉緊張與運動不安等癥狀的精神性疾病。 近年來,該病的發(fā)生率隨著社會壓力的增加而逐年上升,已經(jīng)成為影響人們生活質(zhì)量的主要精神疾病之一[1]。 焦慮癥的病因仍不明確,而在臨床中抗焦慮藥因其不良反應(yīng)較多受到限制[2]。 因此,焦慮癥以及抗焦慮新藥成為醫(yī)藥學(xué)研究的熱點。 焦慮癥的動物模型是研究焦慮癥和研發(fā)抗焦慮新藥的重要載體,為該病的診斷、預(yù)防和治療提供線索和理論指導(dǎo)。 目前有關(guān)焦慮癥的動物模型多達(dá)30 種,大多經(jīng)過臨床有效的抗焦慮藥物檢驗后建立起來的[3-4]。 但部分模型在維持動物焦慮狀態(tài)和評價不同種類抗焦慮藥等方面存在局限性[5]。

防御行為焦慮模型最初是通過受試動物與天敵動物的接觸,造成受試動物的焦慮狀態(tài),但這種方法易致使受試動物軀體創(chuàng)傷;隨后,又發(fā)展為通過暴露天敵氣味來引起受試動物焦慮樣行為的動物模型[6]。 這類模型可稱之為天敵焦慮模型,其優(yōu)點是操作簡便,對動物應(yīng)激的時間短,而焦慮效應(yīng)可持續(xù)1 周以上,便于多個時間點和不同檢測方法對動物模型進行綜合研究[7-9]。 該類模型可用于評價包括苯二氮卓類和三環(huán)類等多種抗焦慮藥,也可用于焦慮癥機制的探索[10]。 因此它可能是一類較為全面地反映焦慮行為表現(xiàn)、作用機制及藥物治療等多方面的焦慮癥動物模型,有利于焦慮癥的發(fā)病機制研究和新藥篩選。 然而,在實際操作中,該類模型所需的天敵動物(貓)在微生物控制等級難以達(dá)到動物屏障系統(tǒng)的要求,使之在SPF 級動物實驗室中應(yīng)用帶來困難。 而天敵氣味的應(yīng)用也存在諸多不足,包括不好控制氣味的投放量,氣味投放過程失當(dāng)容易污染動物房,從而影響其他試驗的進行等。

有研究者發(fā)現(xiàn)聲音驚嚇能誘導(dǎo)動物焦慮樣行為的產(chǎn)生。 Kaltwasser[11]利用10 kHz、110 dB 純音對大鼠進行刺激,成功誘導(dǎo)出動物的焦慮狀態(tài)。 但該模型的缺點是聲音強度太大,一般單調(diào)而高分貝的聲音也可誘發(fā)嚙齒類動物癲癇發(fā)作,提示這種方法還會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他神經(jīng)精神性病變[12]。 有研究人員發(fā)現(xiàn)83.9 dB 的雷鳴聲能引起比格犬產(chǎn)生焦慮狀態(tài),提示在聲音強度不大的情況下,利用恐嚇聲也能誘導(dǎo)出焦慮效應(yīng),為本文提供了很好的思路[13]。 結(jié)合天敵暴露和聲音驚嚇的特點,本課題組嘗試?yán)眠m當(dāng)聲音強度的天敵聲音(貓叫聲)對大鼠建立焦慮癥模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠72 只,體重180 ～200 g,2月齡,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。 動物在福建醫(yī)科大學(xué)新藥安全性評價中心SPF 屏蔽系統(tǒng)動物實驗室[SYXK(閩)2013-0001]飼養(yǎng)和實驗,實驗開展前經(jīng)過福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2017-14)。 大鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)盒內(nèi)喂養(yǎng),每盒5 只,每周換籠兩次,人工照明,明暗各12 h,室溫20℃～26℃,濕度40%～70%。 并嚴(yán)格按照實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

地西泮注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號1201301);0.9%氯化鈉注射液(福州海王福藥制藥有限公司,批號：150401B21);地西泮均用生理鹽水配制到相應(yīng)濃度的溶液進行腹腔注射給藥。 動物視頻行為分析系統(tǒng)(Smart V2.5,Panlab 公司,西班牙);曠場試驗箱(上海移數(shù)信息科技有限公司);大鼠高架十字迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司);音響(SPA 1312,飛利浦,荷蘭); 數(shù)字聲級計TES1350A(泰仕電子工業(yè)股份有限公司,計量鑒定號：1212130252)。

1.3 實驗方法

1.3.1 天敵聲音應(yīng)激

錄制貓叫聲音和白色噪音音頻作為天敵刺激物和參照物,兩種聲音的頻率分別是0 ～22 kHz(中心頻率：2.541 kHz)和0～8 kHz,均在大鼠可接受的聽力范圍內(nèi)[14]。 音頻通過電腦控制音響循環(huán)播放,音響距離應(yīng)激動物籠具1 m 遠(yuǎn),聲音強度通過數(shù)字聲級計控制在(60.0 ± 5.0) dB。 測試房間的背景聲音強度為51.2 dB。

1.3.2 曠場試驗(open-field test, OFT)

大鼠放置于方形敞口的曠場箱(100 cm×100 cm×38 cm)內(nèi),通過動物視頻監(jiān)測系統(tǒng)觀察和分析其在曠場箱內(nèi)5 min 的自主活動情況,記錄和分析的指標(biāo)包括：平均速度、中央?yún)^(qū)(50 cm×50 cm)路程比例和中央?yún)^(qū)停留時間比例。 平均速度作為評價動物自主活動的指標(biāo)。 中央?yún)^(qū)的路程比例和停留時間比例則是反映動物焦慮行為的指標(biāo),兩者的數(shù)值越小則說明動物的焦慮狀態(tài)越嚴(yán)重。 每測試完一只動物需清洗曠場箱的底部和側(cè)壁以使之清潔無異味,測試均在上午九點到中午十二點之間進行。

1.3.3 高架十字迷宮測試(evaluated-plus maze,EPM)

大鼠EPM 是由兩個開臂(50 cm×10 cm)和兩個相對閉臂(50 cm×10 cm×50 cm)及中央平臺區(qū)(10 cm×10 cm)連接而成,裝置離地面高度為50 cm。 放置大鼠于中央平臺區(qū),頭朝開臂,通過動物視頻監(jiān)測系統(tǒng)觀察和分析記錄其在5 min 內(nèi)平均速度、開臂區(qū)路程比例和開臂停留時間比例。 平均速度作為評價動物自主活動的指標(biāo)。 開臂區(qū)路程比例和停留時間的比例則是反映動物焦慮行為的指標(biāo),兩者的數(shù)值越小則說明動物的焦慮狀態(tài)越嚴(yán)重。 每測試完一只動物需清洗實驗裝置以使之清潔無異味,測試均在上午九點到中午十二點之間進行。

1.3.4 單次天敵聲音應(yīng)激

大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白對照組(CON)、白色噪音刺激10 min(WN10) 和60 min 處理組(WN60)、天敵聲音刺激10 min(PS10)和60 min 處理組(PS60),每組8 只。 各組動物在應(yīng)激前(D0),應(yīng)激后第1(D1)和第3 天(D3)進行OFT 測試,以及第7 天(D7)進行EPM 測試,行為學(xué)測試安排見如圖1。

1.3.5 重復(fù)天敵聲音應(yīng)激

大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白對照組(CON)、白色噪音處理組(RWN60)、天敵聲音處理組(RPS60)和天敵聲音+陽性對照處理組(RPS60+DZP),每組8 只。 動物經(jīng)連續(xù)5 d,每天1 次60 min 的應(yīng)激后,分別于第1 天(D1)和第7 天(D7)進行EPM 測試,第3 天(D3)OFT 測試,行為學(xué)測試安排見如圖2。其中,RPS60+DZP 組的動物是在D7 測試前1 h 給予1 mg/kg 的DZP,其余處理同RPS60 組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

通過Graph Pad Prism 7.0 軟件,采用單因素方差分析處理數(shù)據(jù),結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠單次天敵聲音應(yīng)激的行為學(xué)變化

在單次聲音應(yīng)激前的OFT 結(jié)果(圖3A)提示,各組大鼠在平均速度(圖3B)、中央?yún)^(qū)的運動路程比例(圖3C)和停留時間比例(圖3D)均未見顯著性差異(P＞0.05)。 由此可見,各組大鼠的總體運動情況相似,未見顯著的焦慮樣行為,以此推斷同一批購進的SD 大鼠在行為學(xué)上未見明顯的個體差異。 因為重復(fù)應(yīng)激測試的動物與單次應(yīng)激為同一批次,因此重復(fù)應(yīng)激試驗未進行類似的驗證。

圖1 大鼠單次應(yīng)激的行為學(xué)測試安排示意圖Figure 1 Schematic diagram of behavior experimental procedures for rats by single stress

圖2 大鼠重復(fù)應(yīng)激的行為學(xué)測試安排示意圖Figure 2 Schematic diagram of behavior experimental procedures for rats by repeated stresses

圖3 單次應(yīng)激前大鼠在OFT 中的活動情況Figure 3 Activity of rats the before single stress in OFT

經(jīng)過單次聲音應(yīng)激1 d 后(圖4),各組大鼠在曠場中的運動速度相似(P＞0.05,圖4B)。 10 min和60 min 天敵聲音應(yīng)激的大鼠在中央?yún)^(qū)的運動路程比例和停留時間比例均顯著低于空白對照組和白色噪音處理組(P＜0.01,圖4C、4D),而這兩組不同時長天敵聲音應(yīng)激處理組之間則無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。 由此可見,不同時長的天敵聲音刺激在不影響大鼠的總體運動情況下,經(jīng)過1 d 后均能有效引起它們的焦慮樣行為,而相同時長的白色噪音則無焦慮樣行為的變化。

經(jīng)過單次聲音應(yīng)激3 d 后(圖5),各組大鼠在曠場中的運動速度相近(P＞0.05,圖5B)。 10 min和60 min 天敵聲音應(yīng)激的大鼠在中央?yún)^(qū)的運動路程比例和停留時間比例均顯著低于空白對照組和白色噪音處理組(P＜0.01,圖5C、5D),而這兩組不同時長天敵聲音應(yīng)激處理組之間則無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。 由此可見,經(jīng)過天敵聲音刺激3 d 后,大鼠仍處于焦慮狀態(tài)。

圖4 單次應(yīng)激后第1 天(D1)大鼠在OFT 中的活動情況Figure 4 Activity of the rats at day 1 (D1) after single stress in OFT

經(jīng)過單次聲音應(yīng)激7 d 后(圖6),各組大鼠在EPM 中的運動速度一致(P＞0.05,圖6B)。 10 min和60 min 天敵聲音應(yīng)激的大鼠在開臂區(qū)的運動路程比例和停留時間比例均顯著低于空白對照組和白色噪音處理組(P ＜0.01,圖6C、6D),而這兩組不同時長天敵聲音應(yīng)激處理組之間則無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。 由此可見,經(jīng)過單次天敵聲音刺激的大鼠能持續(xù)焦慮狀態(tài)不少于7 d。

2.2 大鼠重復(fù)天敵聲音應(yīng)激的行為學(xué)變化

單次天敵聲音應(yīng)激能使大鼠持續(xù)呈現(xiàn)焦慮樣行為,但重復(fù)刺激是否仍能保持這種效應(yīng)? 反復(fù)應(yīng)激是否會使大鼠對天敵聲音產(chǎn)生耐受呢? 由圖7 的結(jié)果可見,經(jīng)過重復(fù)聲音應(yīng)激1 d 后,各組大鼠在EPM 中的運動速度類似(P＞0.05,圖7B)。 重復(fù)天敵聲音應(yīng)激的大鼠在開臂區(qū)的運動路程比例和停留時間比例均顯著低于空白對照組和白色噪音處理組(P＜0.01,圖7C、7D)。 由此可見,重復(fù)天敵聲音刺激在不影響大鼠的總體運動情況下,經(jīng)過1 d后能有效引起它們的焦慮樣行為。 同樣條件下的白色噪音則無焦慮樣行為的改變。

經(jīng)過重復(fù)聲音應(yīng)激3 d 后(圖8),各組大鼠在曠場中的運動速度相似(P＞0.05,圖8B)。 重復(fù)天敵聲音應(yīng)激的大鼠在中央?yún)^(qū)的運動路程比例和停留時間比例均顯著低于空白對照組和白色噪音處理組(P＜0.01,圖8C、8D)。 由此可見,經(jīng)過重復(fù)天敵聲音刺激3 d 后,大鼠仍處于焦慮狀態(tài)。

經(jīng)過重復(fù)聲音應(yīng)激7 d 后(圖9),各組大鼠在EPM 中的運動速度保持一致(P ＞0. 05,圖9B)。 重復(fù)天敵聲音應(yīng)激的大鼠在開臂區(qū)的運動路程比例和停留時間比例均顯著低于空白對照組和白色噪音處理組(P ＜0. 01),而1 mg/kg 地西泮能顯著提高天敵聲音應(yīng)激大鼠在開臂區(qū)的運動路程比例和停留時間比例(P ＜0. 01,圖9C、9D)。 由此可見,重復(fù)天敵聲音刺激仍能引起大鼠持續(xù)的焦慮樣行為,而且大鼠不會對此聲音產(chǎn)生耐受。

圖5 單次應(yīng)激后第3 天(D3)大鼠在OFT 中的活動情況Figure 5 Activity of the rats at day 3 (D3) after single stress in OFT

圖6 單次應(yīng)激后第7 天(D7)大鼠在EPM 中的活動情況Figure 6 Activity of the rats at day 7 (D7) after single stress in EPM

圖7 重復(fù)應(yīng)激后第1 天大鼠在EPM 中的活動情況Figure 7 Activity of the rats at D1after repeated stresses in EPM

圖8 重復(fù)應(yīng)激后第3 天大鼠在OFT 中的活動情況Figure 8 Activity of the rats at D3 after repeated stresses in OFT

圖9 重復(fù)應(yīng)激后第7 天大鼠在EPM 中的活動情況Figure 9 Activity of the rats at D1after repeated stresses in EPM

3 討論

OFT 和EPM 是評價動物焦慮情緒的經(jīng)典測試方法[15]。 OFT 是由Hall 于1934 年最先提出用于實驗動物行為學(xué)評價,后經(jīng)發(fā)展為評價動物自主行為活動和焦慮行為的經(jīng)典方法[16]。 嚙齒類動物單獨進入曠場后,由于脫離了以往的群居生活,而且曠場面積要比飼養(yǎng)環(huán)境更為寬廣,從而導(dǎo)致動物產(chǎn)生恐懼,尤其是在曠場的中間區(qū)域相比外周區(qū)域更容易受到威脅或攻擊;鑒于嚙齒類動物對曠場中間區(qū)域的好奇探索特性與其顧慮情緒的矛盾沖突,從而使其產(chǎn)生焦慮樣行為,通過記錄動物在曠場中央?yún)^(qū)的行為變化,可以作為動物焦慮情緒的評價指標(biāo)[17]。 EPM 源于高架Y 字型迷宮(elevated Y maze),經(jīng)改進后正式用于焦慮研究[14]。 EPM 用于動物焦慮評價的原理是,EPM 裝置距離地面的高度能使嚙齒類動物在開臂區(qū)產(chǎn)生畏懼情緒,基于嚙齒類動物對高架十字迷宮開臂區(qū)的好奇探索和在開臂區(qū)的危險意識而產(chǎn)生恐懼逃避的心理沖突,而產(chǎn)生焦慮行為的改變,通過記錄動物在EPM 開臂區(qū)的行為變化,可以作為動物焦慮情緒的評價指標(biāo)[18]。需要明確指出的是,這兩種測試方法有時會被誤以為是“焦慮動物模型”,但它們僅能在測試過程中反映動物自身的焦慮行為變化,不能使動物表現(xiàn)出持續(xù)性的焦慮狀態(tài),也不能造成相應(yīng)的病理改變,即焦慮癥的發(fā)生。 因此OFT 和EPM 可用于監(jiān)測動物的焦慮行為變化或評價藥物的抗焦慮效果,但并不能作為探究焦慮癥的發(fā)病機制和針對焦慮癥治療藥物評價的動物模型[5]。 焦慮癥動物模型應(yīng)該是在一定外界刺激條件下產(chǎn)生持續(xù)性的焦慮情緒、相關(guān)的行為學(xué)指征和生化指標(biāo)的變化,而且能被抗焦慮藥所驗證。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),60 dB 天敵聲音刺激能引起SD 大鼠的焦慮樣行為的增加和血漿中ACTH 和皮質(zhì)酮水平的升高,由此提示天敵聲音誘導(dǎo)動物焦慮癥模型的可行性[19]。 然而這個模型還有很多影響因素有待進一步探索,例如天敵聲音的刺激時長和反復(fù)刺激是如何影響該模型的焦慮樣行為變化等。 故本課題組對此進行了探索。

本研究的結(jié)果提示,大鼠在單次天敵聲音刺激后,能維持較高的焦慮效應(yīng)至少7 d,而且10 min 和60 min 的刺激時長引起的焦慮效應(yīng)無差異,從實驗人員便捷省時的角度來看,天敵聲音10 min 刺激的造模條件似乎更佳。 相同條件下的白色噪音則無法增加大鼠的焦慮樣行為。 此外,為了考察天敵聲音刺激的次數(shù)和每次刺激的時長兩方面對模型的影響,本研究進一步通過每天天敵聲音60 min 刺激,持續(xù)5 d 的造模條件,觀察大鼠對刺激源的耐受性。 在重復(fù)天敵聲音刺激5 d 后,大鼠仍能產(chǎn)生焦慮樣行為,其效應(yīng)可持續(xù)至少7 d,相同條件下的白色噪音則無此效應(yīng)。 地西泮作為經(jīng)典的抗焦慮藥,可用于驗證焦慮動物模型[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),地西泮能有效抑制重復(fù)天敵聲音應(yīng)激7 d 后大鼠的焦慮效應(yīng),進一步證明天敵聲音大鼠模型的有效性,并提示該模型可用于抗焦慮藥療效和機制探索的可能性。

由此可見,天敵聲音的強度僅在60 dB、應(yīng)激10 min 內(nèi)即可起焦慮樣行為,其效應(yīng)能持續(xù)至少7 d,而且重復(fù)應(yīng)激不耐受。 因此,天敵聲音誘導(dǎo)的大鼠焦慮模型具有以下優(yōu)勢：(1)操作簡便。 天敵聲音可以直接在籠具旁或測試的動物房內(nèi)播放,避免天敵動物及其氣味進入動物房造成污染,可同時對多只動物進行應(yīng)激。 (2)天敵聲音應(yīng)激的指標(biāo)可控性強。 包括天敵聲音的強度和頻率均可檢測,其強度和播放時長亦易于人為控制。 (3)對操作者和動物的損害較小。 高分貝噪音長時間的刺激會對機體造成損傷,尤其是實驗動物可能會有癲癇、耳聾等的損害[12,21];而因天敵聲音的聲響低和播放的時長較短,不會引起操作者的不適,對動物產(chǎn)生器質(zhì)性病變的風(fēng)險也能有所降低。 鑒于以上,本課題組利用天敵聲音誘導(dǎo)建立了一種便捷可靠的大鼠焦慮模型,可能為焦慮癥的認(rèn)識和抗焦慮新藥篩選提供便利有效的模型工具。