耿 菲,陳瑩瑩,姚婧昕,李世峰,高學敏,徐丁潔,魏中秋,楊 方,徐 洪?

(1.華北理工大學基礎醫(yī)學院,河北 唐山 063000; 2.華北理工大學醫(yī)學實驗研究中心,河北 唐山 063000;3.華北理工大學中醫(yī)學院,河北 唐山 063000)

矽肺(silicosis)是長期吸入大量含有游離的二氧化硅(silicon dioxide, SiO2)粉塵而引起以矽結(jié)節(jié)和彌漫性肺間質(zhì)纖維化為主要病變的慢性進行性塵肺病[1],矽肺的發(fā)病機制復雜,涉及多層面、多階段、多種細胞的參與,特征性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的肌成纖維細胞被認為是器官纖維化形成過程中產(chǎn)生過量細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)的最主要和最重要的細胞[2-3],而上皮細胞可以通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)轉(zhuǎn)化為成纖維細胞/肌成纖維細胞[4-6]。 Rho GDP 解離抑制因子 α (Rho GDP dissociation inhibitor α, Rho GDIα)是本課題組應用雙向凝膠電泳技術在TGFβ1 誘導的大鼠原代肺成纖維細胞中篩選出來的一個差異性蛋白,Rho GDIα 作為蛋白伴侶,是Rho GTP 酶生物活性調(diào)節(jié)的關鍵因子,在細胞分化、骨架調(diào)控等方面起重要作用,并與細胞增殖、凋亡等生命活動密切相關[7]。 然而,Rho GDIα 能夠通過調(diào)節(jié)EMT 從而調(diào)控矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展尚無文獻報道。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549 購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑

人重組TGF-β1(240-B)購置于美國R&D 公司;Rho GDIα 抗體(A1214)購置于武漢ABclonal 公司;RhoA 抗體(ab32046)購置于美國Epiyomics 公司;ROCK 抗體(ab4517)購置于美國Abcam 公司;α-SMA 抗體(1184-1)購置于美國Epiyomics 公司;Ecad 抗體(ab76055) 購置于美國Abcam 公司;Collagen-I 抗體(AF0134)購置于美國Affinity 公司;Tubulin-α 抗體(AF7010)購置于美國Affinity 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549 培養(yǎng)及分組

人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549 常規(guī)培養(yǎng),分為：1)空載體慢病毒組(Lentivirus empty vector, LEV)：感染空載體慢病毒;2)沉默Rho GDIα 慢病毒感染組(Lv-Rho GDIα-inhibition)：感染沉默Rho GDIα 的慢病毒;3)TGF-β1 誘導LEV 組(LEV+TGF-β1)：感染空載體慢病毒的穩(wěn)定細胞株給予TGF-β1(5 ng/mL) 孵 育24 h;4) TGF-β1 誘 導Lv-Rho GDIαinhibition 組(Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1)：感染沉默Rho GDIα 的穩(wěn)定細胞株給予TGF-β1(5 ng/mL)孵育24 h。

1.3.2 Western blot 法 檢 測Rho GDIα、 RhoA、ROCK、E-cad、α-SMA 及collagen-I 蛋白的表達

提取A549 細胞蛋白,Brafford 法測定蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,5%牛血清白蛋白封閉1 h,一抗Rho GDIα、RhoA、ROCK、Ecad、α-SMA 及collagen-I(1 ∶500)、Tubulin-α(1 ∶1000)4℃孵育過夜,二抗(1 ∶5000)37℃孵育30 min。 電化學發(fā)光顯影(美國伯樂公司),用Image Lab 軟件測定條帶OD 值,以目標蛋白與內(nèi)參蛋白的比值作為蛋白的相對表達量。

1.3.3 免疫細胞化學染色法檢測α-SMA 的表達

每孔6×103個細胞密度制備細胞爬片,按實驗設計刺激細胞,用4%多聚甲醛固定40 min,脫中性樹膠染色。 孵育一抗α-SMA(1 ∶100)4℃過夜,二抗37℃1 h,DAB 顯色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞增殖情況

細胞接種到96 孔板中,每孔細胞濃度約為5×104,約100 μL 細胞懸液。 在培養(yǎng)基中加10 μL CCK-8 試劑,加完試劑后輕慢敲擊培養(yǎng)板幫助混勻。按實驗設計培養(yǎng)相應的時間,酶標儀檢測各組細胞在450 nm 處的吸光度(OD),以OD 值作為判斷細胞增殖能力的指標。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析。 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示,用Levene 法行方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析;P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用

Western blot 方法檢測Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表達水平(圖1,表1),Lv-Rho GDIα-inhibition 組細胞中Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達水平明顯低于LEV 對照組,是LEV 對照組的19.99%、35.89%、36.60%(P ＜0.05);LEV+TGF-β1 組 細 胞 中Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達水平明顯高于LEV 對照組,是LEV 對照組的3.33 倍、3.99 倍、3.06 倍(P＜0.05);Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 組細胞中Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達水平低于LEV+TGF-β1組,是LEV+TGF-β1 組的65.19%、53.69%、71.31%(P＜0.05),差異均具有統(tǒng)計學意義。

2.2 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的人肺泡Ⅱ型上皮細胞的上皮標志蛋白E-cad 和間質(zhì)標志蛋白α-SMA 表達的調(diào)節(jié)作用

Western blot 方法檢測上皮標志蛋白E-cad 表達水平(圖2,表2),統(tǒng)計結(jié)果提示,Lv-Rho GDIαinhibition 組細胞中E-cad 蛋白表達水平明顯高于LEV 對照組,是LEV 對照組的1.58 倍(P＜0.05);LEV+TGF-β1 組細胞中E-cad 蛋白表達水平明顯低于LEV 對照組,是LEV 對照組的6.26%(P＜0.05);Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 組細胞中E-cad 蛋白表達水平高于LEV+TGF-β1 組,是LEV+TGF-β1組的7.48 倍(P＜0.05),差異均具有統(tǒng)計學意義。

表1 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用( ± s, n=3)Table 1 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of Rho GDIα, RhoA and ROCK in A549 cells induced by TGF-β1

表1 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用( ± s, n=3)Table 1 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of Rho GDIα, RhoA and ROCK in A549 cells induced by TGF-β1

注：與空載體慢病毒組比較,?P＜0.05;與TGF-β1 誘導LEV 組比較,??P＜0.05。Note. Compared with the LEV group, ?P＜0.05. Compared with the LEV+TGF-β1 group, ??P＜0.05.

組別Groups Rho GDIα RhoA ROCK空載體慢病毒組LEV group 0.35±0.04 0.17±0.01 0.40±0.02沉默Rho GDIα 慢病毒感染組Lv-Rho GDIα-inhibition group 0.07±0.01? 0.06±0.01? 0.14±0.00?TGF-β1 誘導LEV 組LEV+TGF-β1 group 1.15±0.24? 0.68±0.09? 1.21±0.06?TGF-β1 誘導Lv-Rho GDIα-inhibition 組Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 group 0.75±0.14?? 0.37±0.05?? 0.86±0.01??F 值F value 34.49 87.41 631.80

Western blot 方法檢測間質(zhì)標志蛋白α-SMA 表達水平(圖2,表2),統(tǒng)計結(jié)果提示,Lv-Rho GDIαinhibition 組細胞中α-SMA 蛋白表達水平明顯低于LEV 對照組,是LEV 對照組的56.97%(P ＜0.05);LEV+TGF-β1 組細胞中α-SMA 蛋白表達水平明顯高于LEV 對照組,是LEV 對照組的2.37 倍(P＜0.05);Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 組細胞中α-SMA 蛋白表達水平低于LEV+TGF-β1 組,是LEV+TGF-β1 組的78.54%(P＜0.05),差異均具有統(tǒng)計學意義。

免疫細胞化學染色結(jié)果顯示(圖3),LEV+TGFβ1 組細胞胞漿中有較多的棕黃色肌絲樣α-SMA 陽性表達,而Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 組中α-SMA 陽性表達細胞數(shù)量明顯減少。

2.3 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的collagen-I 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用

Western blot 方法檢測collagen-I 蛋白表達水平(圖2,表2), Lv-Rho GDIα-inhibition 組 細 胞 中collagen-I 蛋白表達水平明顯低于LEV 對照組,是LEV 對照組的22.48%(P＜0.05);LEV+TGF-β1 組細胞中collagen-I 蛋白表達水平明顯高于LEV 對照組,是LEV 對照組的4.44 倍(P ＜0.05);Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 組細胞中collagen-I 蛋白表達水平低于LEV+TGF-β1 組,是LEV+TGF-β1 組的90.81%(P＜0.05),差異均具有統(tǒng)計學意義。

圖2 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的E-cad、α-SMA、collagen-I 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用Figure 2 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of E-cad, α-SMA and collagen-I in A549 cells induced by TGF-β1

表2 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的E-cad、α-SMA、collagen-I 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用( ± s, n=3)Table 2 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of E-cad, α-SMA and collagen-I in A549 cells induced by TGF-β1

表2 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的E-cad、α-SMA、collagen-I 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用( ± s, n=3)Table 2 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of E-cad, α-SMA and collagen-I in A549 cells induced by TGF-β1

注：與空載體慢病毒組比較,?P＜0.05;與TGF-β1 誘導LEV 組比較,??P＜0.05。Note. Compared with the LEV group, ?P＜0.05. Compared with the LEV+TGF-β1 group, ??P＜0.05.

組別Groups E-cad α-SMA Collagen-I空載體慢病毒組LEV group 0.53±0.02 0.39±0.05 0.12±0.01沉默Rho GDIα 慢病毒感染組Lv-Rho GDIα-inhibition group 0.83±0.22? 0.22±0.07? 0.03±0.01?TGF-β1 誘導LEV 組LEV+TGF-β1 group 0.03±0.00? 0.92±0.10? 0.54±0.04?TGF-β1 誘導Lv-Rho GDIα-inhibition 組Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 group 0.25±0.02?? 0.72±0.10?? 0.49±0.03??F 值F value 28.52 43.12 284.56

圖3 沉默Rho GDIα 對A549 細胞α-SMA 蛋白表達的影響(免疫細胞化學染色)Figure 3 The effect of Rho GDIα knockdown on the expression of α-SMA in A549 cells(Immunocytochemical staining)

2.4 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖能力的影響

CCK-8 法檢測細胞增殖能力,結(jié)果顯示(表3),與LEV 對照組相比,Lv-Rho GDIα-inhibition 組細胞生長明顯受抑制,24 h、48 h、72 h Lv-Rho GDIαinhibition 組OD 值分別是LEV 對照組的75.88%、61.37%、72.37%(P ＜0.05);與LEV 對照組相比,LEV+TGF-β1 組細胞生長增強,12 h、24 h、48 h、72 h LEV+TGF-β1 組OD 值分別是LEV 對照組的1.52倍、1.77 倍、1.60 倍、1.73 倍(P ＜0.05);與LEV+TGF-β1 組相比,Lv-RhoGDIα-inhibition+TGF-β1 組細胞生長受抑制,12 h、24 h、48 h、72 hLv-Rho GDIαinhibition+TGF-β1 組OD 值是LEV+TGF-β1 組的72.09%、65.35%、60.38%、54.45%(P＜0.05),差異均具有統(tǒng)計學意義。

Western blot 方法檢測細胞周期蛋白(cyclin)D1蛋白表達水平(圖4,表4),Lv-Rho GDIα-inhibition組細胞中cyclin D1 蛋白表達水平明顯低于LEV 對照組,是LEV 對照組的29.21%(P ＜0.05);LEV+TGF-β1 組細胞中cyclin D1 蛋白表達水平明顯高于LEV 對照組,是LEV 對照組的3.25 倍(P＜0.05);Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 組細胞中cyclin D1蛋白表達水平低于LEV+TGF-β1 組,是LEV+TGFβ1 組的70.69%(P＜0.05),差異均具有顯著性。

表3 CCK-8 實驗結(jié)果( ± s,n=3)Table 3 Results of CCK-8 assay

表3 CCK-8 實驗結(jié)果( ± s,n=3)Table 3 Results of CCK-8 assay

注：與空載體慢病毒組比較,?P＜0.05;與TGF-β1 誘導LEV 組比較,??P＜0.05。Note. Compared with LEV group, ?P＜0.05. Compared with the LEV+TGF-β1 group, ??P＜0.05.

組別Groups OD 0 h 6 h 12 h 24 h 48 h空載體慢病毒組LEV group 1.66±0.31 2.28±0.07 2.29±0.42 2.80±0.35 3.60±0.24沉默Rho GDIα 慢病毒感染組Lv-Rho GDIα-inhibition group 1.73±0.03 2.04±0.29 2.15±0.49 2.12±0.14? 2.21±0.03?TGF-β1 誘導LEV 組LEV+TGF-β1 group 1.70±0.21 2.50±0.40 3.48±0.29? 4.94±0.09? 5.76±0.34?TGF-β1 誘導Lv-Rho GDIα-inhibition 組Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 group 1.69±0.28 2.48±0.21 2.51±0.35?? 3.23±0.17?? 3.48±0.40??F 值F value 0.05 1.84 7.07 99.77 77.62

圖4 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的cyclin D1 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用Figure 4 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of cyclin D1 in A549 cells induced by TGF-β1

表4 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的cyclin D1 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用( ± s, n=3)Table 4 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of cyclin D1 in A549 cells induced by TGF-β1

表4 沉默Rho GDIα 對TGF-β1 誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的cyclin D1 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用( ± s, n=3)Table 4 Regulating effect of Rho GDIα knockdown on the expression of cyclin D1 in A549 cells induced by TGF-β1

注：與空載體慢病毒組比較,?P＜0.05;與TGF-β1 誘導LEV 組比較,??P＜0.05。Note. Compared with LEV group, ?P＜0.05. Compared with the LEV+TGF-β1 group, ??P＜0.05.

組別Groups Cyclin D1空載體慢病毒組LEV group 0.07±0.01沉默Rho GDIα 慢病毒感染組Lv-Rho GDIα-inhibition group 0.02±0.00?TGF-β1 誘導LEV 組LEV+TGF-β1 group 0.24±0.04?TGF-β1 誘導Lv-Rho GDIα-inhibition 組Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1 group 0.17±0.03??F 值F value 40.76

3 討論

Rho GDP 解離抑制因子(Rho GDP dissociation inhibitor, Rho GDI)家族包括Rho GDIα、Rho GDIβ和Rho GDIγ 三個亞型,其中Rho GDIα 是表達最廣泛、研究最深入的亞型[8]。 目前發(fā)現(xiàn)Rho GDIα 在肝癌中表達上升,且與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及預后相關[9];另外一些研究也發(fā)現(xiàn)Rho GDIα 在膠質(zhì)瘤、前列腺癌等惡性腫瘤中表達下降,且高表達者多分化好、不易轉(zhuǎn)移、侵襲能力弱及預后較好[10-11]。 但Rho GDIα 在同一腫瘤中的表達水平也并不一致,Song 等發(fā)現(xiàn)Rho GDIα 是肺腺癌的轉(zhuǎn)移抑制因子[12],韓昱晨等則表明Rho GDIα 在肺癌高轉(zhuǎn)移亞型中表達上調(diào)[13]。 目前尚不清楚造成這一差異的確切原因,可能與腫瘤亞型、研究方法或是樣本數(shù)量有關。 本實驗研究發(fā)現(xiàn),用TGF-β1 誘導A549 細胞后,Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達明顯上調(diào),伴隨上皮標記蛋白E-cad 的減弱與下調(diào),間質(zhì)標記蛋白α-SMA 和collagen-I 蛋白的表達增強和上調(diào),而慢病毒感染沉默Rho GDIα 后,可下調(diào)Rho GDIα、RhoA、ROCK 蛋白表達,降低α-SMA 和collagen-I 蛋白的表達,逆轉(zhuǎn)上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,提示TGF-β1 誘 導A549 細 胞 后,Rho GDIα/RhoA/ROCK 信號通路參與了肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)過程。

近年來研究發(fā)現(xiàn)作為蛋白伴侶的Rho GDIα 是Rho GTP 酶生物活性調(diào)節(jié)的關鍵因子,在細胞分化、骨架調(diào)控等方面起重要作用,并與細胞增殖、凋亡等生命活動密切相關[14]。 Rho GTP 酶是重要的細胞內(nèi)信號分子,參與許多細胞生理進程包括調(diào)控細胞形態(tài)改變、細胞骨架重組、細胞粘附、細胞周期、細胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等[15]。 研究發(fā)現(xiàn),RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路參與多種器官纖維發(fā)生、發(fā)展過程,通過激活RhoA/ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路,上調(diào)靶細胞α-SMA 蛋白的表達,可促進間質(zhì)細胞和上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[16-18]。 而Rho GDIα 通過調(diào)控RhoA/ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路,如何調(diào)節(jié)上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化呢? 本實驗Western blot 和CCK-8 結(jié)果顯示,TGF-β1 誘導A549 細胞后,cyclin D1 蛋白表達上升,細胞增殖能力增強,而沉默Rho GDIα 后,cyclin D1 蛋白表達下降,細胞增殖能力減弱,提示TGF-β1 誘導A549 細胞后,上皮細胞數(shù)量增多,向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化增強,沉默Rho GDIα后,抑制RhoA/ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路,上皮細胞數(shù)量減少,向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化減弱。