趙麗 章淑芳 周楊 范麗丹 青艷 張莉涵

肺癌發(fā)病率及死亡率均位于惡性腫瘤第一位，全球數(shù)據(jù)顯示，每年因肺癌死亡患者約150萬人，死亡率高達(dá)25%以上[1]。肺癌依據(jù)其病理類型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌患者占總數(shù)85%左右[2]。非小細(xì)胞肺癌包括大細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌等。肺腺癌(Lung adenocarcinoma ,LAD)的發(fā)生率占肺癌總數(shù)的30～35%[3]，每年全球因LAD死亡人數(shù)約50萬人。雖然ALK、EGFR-TKI等靶向藥物給這些敏感基因突變的LAD患者帶來生存獲益，但是對(duì)于無敏感基因突變的進(jìn)展期LAD患者生存時(shí)間仍然較低，因此仍需要發(fā)現(xiàn)更多有效的治療靶點(diǎn)，使進(jìn)展期LAD患者能有更多有效的治療方案，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前的癌癥相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含GEO、TCGA、癌癥基因芯片及已發(fā)表的研究數(shù)據(jù)，并整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，能在線進(jìn)行基因差異性表達(dá)及預(yù)后等分析。該數(shù)據(jù)庫已經(jīng)有超過715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù),86733個(gè)癌癥組織和正常組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)。利用該數(shù)據(jù)庫能篩選出常見腫瘤與正常組織中差異表達(dá)基因，并且該數(shù)據(jù)庫中還包括轉(zhuǎn)移、病例類型、分期及生存時(shí)間等，因此對(duì)Oncomine充分應(yīng)用能初步挖掘出某癌癥的相關(guān)基因，不僅可作為后期實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)支持，還能節(jié)約研究時(shí)間及經(jīng)費(fèi)。Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌相關(guān)mRNA和乳腺癌相關(guān)miRNA與預(yù)后的分析。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor‐β，TGF-β)是一種參與細(xì)胞多種生物學(xué)過程的細(xì)胞因子，其主要作用于內(nèi)皮細(xì)胞，參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、彌散以及血管內(nèi)皮形成等(10.1038/cr.2008.326)。TGF-β有三種分子亞型包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，TGF-β蛋白受體有兩種類型激酶受體(TGFβRI、TGFβRⅡ)，通常情況下TGFβRⅡ受體與其配體結(jié)合后使TGFβRI 磷酸化，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，例如ALK、Smad2/3等[4]。研究顯示TGF-β1主要作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管出芽誘導(dǎo)血管生成[5]，目前關(guān)于TGF-β2的認(rèn)識(shí)尚缺乏，有學(xué)者認(rèn)為TGF-β2能降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-2的表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)[4]，不僅如此，TGF-β2還可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β2通過上調(diào)SNAIL、鋅指轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymal transition , EndMT)，EndMT過程與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)，而EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，因此猜測(cè)TGF-β2可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，本研究將通過Oncomine數(shù)據(jù)庫篩選與肺腺癌相關(guān)的基因，并結(jié)合Kaplan-meier Plotter計(jì)算TGF-β2與肺腺癌生存時(shí)間的相關(guān)性，旨在了解TGF-β2與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系，為肺腺癌治療靶點(diǎn)提供新選擇。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)來源與提取

本研究首先在Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html )數(shù)據(jù)庫中用以下檢索詞進(jìn)行檢索：“Cancer type:lung adenocarcinoma cancer”；“Gene：TGF-β2”；“Date type：All”；Analysis type：Cancer vs Normal Analysis；臨界值設(shè)定為：P value<0.05，fold change>2，gene rank=all。再檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫中TGF-β2與肺腺癌患者生存時(shí)間相關(guān)性數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，整合，結(jié)合Kaplan-meier Plotter(https://www.kmplot.com.analysis)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析。Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫檢索條件為：Cancer：lung cancer，Pathological type：adenocarcinoma；Gene：TGF-β2；Split patients by:Auto select best cutoff;Survival：OS；Follow up threshold：All?？偵鏁r(shí)間(overall survival,OS)定義為入組觀察至任何原因所致死亡時(shí)間。

二、統(tǒng)計(jì)方法

本研究采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫和SPSS 23．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)描述TGF-β2基因的表達(dá)量，其在正常組織與肺腺癌組織的差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Kaplan—Meier法分析TGF-β2表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系，組間比較用Log-rank檢驗(yàn)。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TGF-β2在實(shí)體腫瘤中表達(dá)結(jié)果

Oncomine數(shù)據(jù)庫中關(guān)于TGF-β2在惡性腫瘤與正常組織表達(dá)量的研究有456個(gè)，其中44個(gè)研究中TGF-β2在腫瘤組織中表達(dá)顯著上升，34個(gè)研究結(jié)果顯示TGF-β2表達(dá)下降，5個(gè)肺癌的研究數(shù)據(jù)顯示TGF-β2在腫瘤組織中表達(dá)降低(見圖1)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TGF-β2在腫瘤中表達(dá)差異

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)TGF-β2在肺癌中差異性表達(dá)，且位于所有差異基因第1537位，P=1.25E-8(見圖2)。分別提取5項(xiàng)研究原始數(shù)據(jù)匯總分析，結(jié)果顯示，TGF-β2在正常肺組織中表達(dá)水平為0.151±0.21，肺癌組織中表達(dá)量為-2.031±0.32，對(duì)比正常肺組織，TGF-β2基因在肺癌組織中表達(dá)降低P<0.0001(見圖3)。剔除非腺癌研究數(shù)據(jù)，TGF-β2在正常肺組織與肺腺癌組織中表達(dá)量分別為0.597±0.17、-1.529±0.29，肺腺癌組織中TGF-β2表達(dá)顯著降低P<0.0001(見圖4)，Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行薈萃分析結(jié)果顯示TGF-β2位于肺腺癌差異基因排序的第1592位，P=0.007(見圖5)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TGF-β2在肺癌組織表達(dá)差異

圖3 TGF-β2在肺癌和正常肺組織中表達(dá)差異

二、TGF-β2在肺腺癌中表達(dá)差異

結(jié)合4項(xiàng)研究箱圖數(shù)據(jù)顯示：TGF-β2在腫瘤組織中表達(dá)低于正常肺組織(見圖6)。

三、TGF-β2表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

為了進(jìn)一步研究TGF-β2表達(dá)是否影響肺腺癌患者生存時(shí)間，我們將Oncomine數(shù)據(jù)庫中Beer DG[6]等人研究的生存時(shí)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集、整理(提取的原始數(shù)據(jù)見附錄1)，該研究總納入85例肺腺癌患者，TGF-β2表達(dá)中位表達(dá)量為-2.59，我們?cè)O(shè)定為表達(dá)量高于中位數(shù)為高表達(dá)，其中高表達(dá)患者43例，低表達(dá)42例；中位隨訪時(shí)間為30.6m(2.4～110m)。統(tǒng)計(jì)分析顯示TGF-β2高表達(dá)患者生存時(shí)間更長(zhǎng)(HR=0.43,95%CI:0.21～0.89,P=0.02)(見圖7)。然后我們從Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)中提取TGF-β2與患者總生存時(shí)間的關(guān)系，對(duì)TGF-β2與肺腺癌患者生存時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制生存曲線圖，結(jié)果顯示TGF-β2高表達(dá)的肺癌患者OS略優(yōu)于低表達(dá)患者(HR=0.83,95%CI:0.73～0.94,P=0.0029)，且這種生存優(yōu)勢(shì)在肺腺癌患者中更加明顯(HR=0.46,95%CI:0.34～0.61,P<0.0001)(見圖8)。

圖4 TGF-β2在肺腺癌和正常肺組織中表達(dá)差異

圖5 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TGF-β2在肺腺癌中表達(dá)差異

圖6 TGF-β2在肺腺癌與正常組織表達(dá)差異

圖7 TGF-β2表達(dá)量與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

討 論

一直以來，肺癌的發(fā)生率及死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人們的生命健康，我國每年新增肺癌病例將超過100萬人，發(fā)病人數(shù)位居世界首位[7]，肺腺癌更是肺癌中主要的病理類型。盡管EGFR、ALK等基因突變的肺腺癌患者能從靶向藥物中獲益，但是僅有70%～80%肺腺癌患者有敏感基因突變，仍有一部分無驅(qū)動(dòng)基因或敏感基因靶向治療耐藥的患者預(yù)后較差，總體來說，我國肺癌患者5年OS僅10%～15%，因此仍需要積極探索新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

TGF-β家族具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫應(yīng)答及損傷修復(fù)等過程。研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TGF-β對(duì)血管的生成有至關(guān)重要的作用，主要體現(xiàn)在以下方面：1)TGF-β誘導(dǎo)免疫細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等聚集，后者釋放出大量促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子；2)TGF-β1直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型發(fā)生改變，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)；3)TGF-β能與GATA 6啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[8]。TGF-β家族配體與受體結(jié)合后(TGF-β I型受體及Ⅱ型受體)，激活信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)功能。但是有研究報(bào)道TGF-β2與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等一起促進(jìn)血管生成，進(jìn)而參與眼部新生血管性疾病的發(fā)生[9]。McDowell 等[10]發(fā)現(xiàn)TGF-β2能激活Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重塑改變細(xì)胞骨架，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。不僅如此，TGF-β2還可能與上皮細(xì)胞增生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)：經(jīng)TGF-β2刺激后晶狀體上皮細(xì)胞增生受到明顯抑制，隨著TGF-β2濃度及時(shí)間的增加其抑制作用更加明顯[11]。TGF-β2還能激活Notch信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。

圖8 KMP數(shù)據(jù)庫中TGF-β2表達(dá)水平與肺癌患者OS的關(guān)系

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因而猜想TGF-β2可能在腫瘤中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，但TGF-β2對(duì)腫瘤的作用存在較大爭(zhēng)議，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β2與高級(jí)別膠質(zhì)瘤發(fā)展相關(guān)，最初認(rèn)為其作為膠質(zhì)母細(xì)胞來源的T細(xì)胞抑制因子，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者免疫抑制相關(guān)，因此TGF-β2高表達(dá)膠質(zhì)瘤患者疾病分期更晚及預(yù)后較差[13]，同樣，張東勇等[14]發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中TGF-β2表達(dá)水平明顯升高，沉默其表達(dá)能顯著降低腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲能力，因此他們認(rèn)為TGF-β2高表達(dá)水平可能是腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。楊秀華等[15]采用免疫組化檢測(cè)30例外陰癌患者組織TGF-β2表達(dá)水平，他們發(fā)現(xiàn)TGF-β2在腫瘤組織中表達(dá)水平顯著高于正常組織，且高表達(dá)TGF-β2患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而我們首先檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫中TGF-β2在實(shí)體腫瘤中表達(dá)水平，包括456個(gè)研究數(shù)據(jù)，其中表達(dá)升高的有44個(gè)研究，表達(dá)降低有34項(xiàng)研究，對(duì)比正常肺組織，5項(xiàng)研究結(jié)果顯示肺癌組織中TGF-β2表達(dá)顯著下降，無表達(dá)上升的研究數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選肺腺癌數(shù)據(jù)支持TGF-β2在肺腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)。為了進(jìn)一步探索TGF-β2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，我們結(jié)合Kaplan—Meier Plotte數(shù)據(jù)庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β2低表達(dá)肺癌患者總生存時(shí)間更短，這一差異在肺腺癌患者中更加顯著，因此TGF-β2低表達(dá)是肺腺癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，TGF-β2在肺腺癌組織中表達(dá)顯著降低，且其低表達(dá)患者預(yù)后較差，故TGF-β2有望成為肺腺癌患者評(píng)估預(yù)后的分子標(biāo)志物，甚至作為新的藥物治療靶點(diǎn)，給肺腺癌患者提供新的治療手段。雖然本研究利用大數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行分析，避免了個(gè)別小樣本研究數(shù)據(jù)的偏移，但是缺乏機(jī)制研究，TGF-β2是如何影響肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為尚不清楚，因此仍需進(jìn)一步探索。