陸 超 奚肇慶 吳 磊 田立元▲

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，江蘇南京 210029

升降丸由生大黃、姜黃、炒僵蠶、蟬蛻組成，其方源于清代楊粟山所著《傷寒溫疫條辨》一書(shū)，具有宣泄三焦，行氣解散，調(diào)和氣血，升清降濁之功效[1-4]。用于惡寒發(fā)熱，寒戰(zhàn)高熱，煩躁不寧等癥狀。大量臨床研究顯示[5-10]，升降方可有效降低患者體溫，縮短發(fā)熱持續(xù)時(shí)間并有效防止體溫復(fù)升，有利于減少高熱并發(fā)癥的發(fā)生。方中炒僵蠶能勝風(fēng)除濕、清熱解郁[11]；姜黃具有行氣散郁、辟疫除煩之功效[12-13]；大黃上下通行，清熱瀉火。大黃是方中一味主藥，其主要活性成分為蒽醌類(lèi)化合物，包括結(jié)合型蒽醌和游離型蒽醌兩類(lèi)，具有止血、抗菌、排毒等藥理作用[14-15]，與本方的功效相一致，本研究將蒽醌類(lèi)成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為指標(biāo)，以控制升降丸的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters-2695 高效液相色譜儀、Waters-2998 二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)，Waters 公司）；萬(wàn)分之一天平（BP-211D 型，德國(guó)賽多利斯公司）；醫(yī)用超聲波清洗儀（KQ-1000E 型，昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與試藥

升降丸（江蘇省中醫(yī)院制劑部自制，批號(hào)：201708 001、201708002、201708003）；大黃對(duì)照藥材（鑒別用，批號(hào)：121249-201304）、姜黃對(duì)照藥材（鑒別用，批號(hào)：121188-201304）、大黃素對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110756-201512）、大黃酸對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110757-200106）、蘆薈大黃素對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110795-201308）、大黃酚對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110796-201319）、大黃素甲醚對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：110758-201405），以上均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 姜黃 取升降丸2 g，研細(xì)，加無(wú)水乙醇50 mL，搖勻，放置30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇2 mL 使之溶解，作為供試品溶液；取不含姜黃的陰性粉末，同法制備陰性對(duì)照品溶液；另取姜黃對(duì)照藥材0.2 g，同法制成姜黃對(duì)照藥材溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置日光下檢視。在供試品溶液色譜中，與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃薄層色譜鑒別圖

2.1.2 大黃 取升降丸5 g，研細(xì)，加入甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?00 mL 使之溶解，加入鹽酸7 mL，加熱回流30 min，取出，放冷，濾液用乙醚振搖提取2 次，每次50 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，作為供試品溶液。另取不含大黃的陰性溶液，同法制備陰性對(duì)照品溶液；取大黃對(duì)照藥材粉末0.2 g，加甲醇20 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于相同的以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，置于氨蒸氣中熏后斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。在供試品溶液色譜中，與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 大黃薄層色譜鑒別圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，置于量瓶中，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL 含蘆薈大黃素108.9 μg、大黃酸115.0 μg、大黃素119.0 μg、大黃酚119.0 μg、大黃素甲醚56.8 μg 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將升降丸研細(xì)，取2 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL 和鹽酸3 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，精密稱(chēng)定，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，超聲處理20 min，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[16]。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜條件Hedera C18ODS-2 色譜柱 （4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸水（80∶20）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min。

精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。供試品色譜與對(duì)照品色譜在相同的位置有較大吸收，陰性對(duì)照無(wú)干擾。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于3000。見(jiàn)圖3。

圖3 升降丸液相色譜圖

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 取上述對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至含蘆薈大黃素108.90、72.60、48.40、32.27、21.51、14.34、9.56、6.37 μg/mL，含大黃酸115.00、76.67、51.11、34.07、22.72、15.14、10.10、6.73 μg/mL，含大黃素119.00、79.33、52.89、35.26、23.51、15.67、10.45、6.96 μg/mL，含大黃酚119.00、79.33、52.89、35.26、23.51、15.67、10.45、6.96 μg/mL，含 大 黃 素 甲 醚56.80、37.87、25.24、16.83、11.22、7.48、4.99、3.32 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密吸取各不同濃度的對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中測(cè)定。經(jīng)線(xiàn)性回歸分析顯示，蘆薈大黃素在6.37～108.90 μg/mL范圍內(nèi)，大黃酸在6.73～115.00 μg/mL 范圍內(nèi)，大黃素在6.96～119.00 μg/mL 范圍內(nèi)，大黃酚在6.96～119.00 μg/mL范圍內(nèi)，大黃素甲醚在3.32～56.80 μg/mL 范圍內(nèi)，分別與峰面積的積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一個(gè)對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，重復(fù)測(cè)定6 次，以峰面積積分值計(jì)算，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為0.49%、0.36%、0.22%、0.46%、1.64%。結(jié)果顯示，儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)批次（201708001）的升降丸2 g，研細(xì)，共6 份，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下處理方法制備供試品溶液。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含 量 計(jì) 算，RSD 值 分 別 為0.87%、0.76%、1.02%、1.21%、1.37%。結(jié)果顯示，該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一個(gè)供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、6、8、12 h 分別進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，分別以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量計(jì)算，RSD 值分別為0.67%、0.94%、0.88%、1.43%、1.13%。結(jié)果顯示，樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的升降丸（201708001）1 g，共6 份，分別加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量。按“2.2.2”項(xiàng)下處理方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回收率分別為89.91%、92.87%、91.24%、93.50%、88.64%，RSD 值分別為2.12%、1.06%、1.67%、2.31%、2.46%。結(jié)果顯示，該方法的準(zhǔn)確性良好，符合含量測(cè)定的要求。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3 個(gè)批次的升降丸樣品，每個(gè)批次2 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算。3 個(gè)批次樣品中大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

大黃其性苦寒，是升降丸全方中的主藥。本實(shí)驗(yàn)按照2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》[17]中大黃含量測(cè)定項(xiàng)下要求，選擇蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為質(zhì)控指標(biāo)。

3.2 色譜條件的選擇

大黃蒽醌類(lèi)成分的含量測(cè)定的流動(dòng)相組成有：甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)、甲醇-0.2%磷酸系統(tǒng)、甲醇-0.4%磷酸系統(tǒng)、甲醇-乙腈-三乙胺系統(tǒng)以及乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)等[18-24]。預(yù)試驗(yàn)[25]顯示甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）系統(tǒng)可以較好地分離5 種指標(biāo)成分，重復(fù)性較好。