王 歡,Iram Maqsood,周蘇園,滕 威,戎 可,*

1 東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院,哈爾濱 150040 2 國家林業(yè)局野生動物保護學(xué)重點開放實驗室,哈爾濱 150040 3 北京巧女公益基金會,北京 100012

鳥綱啄木鳥目(Piciformes)啄木鳥科(Picidae)現(xiàn)生共33個屬254種[1],因其通常啄木取食而通稱啄木鳥。除取食外,啄木鳥通常在喬木樹干上鑿洞棲息,撫育幼鳥,這些樹洞最終被其他的小型鳥獸占用,因此,啄木鳥對森林生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的維持具有重要意義[2-4]。另外,由于其取食行為的特殊性,啄木鳥對于生境變化非常敏感,使其成為森林生態(tài)系統(tǒng)健康的重要指示物種[5],具有重要的保護與監(jiān)測意義。

啄木鳥廣泛分布于除南極洲,澳大利亞,新幾內(nèi)亞以及馬達加斯加以外的各個大陸[6]。幾乎有森林覆蓋的區(qū)域就有啄木鳥存在,甚至有少數(shù)物種如Melanerpesuropygialis和Melanerpeshypopolius,利用仙人掌在荒漠地區(qū)定居[7],最終形成分布熱點位于赤道附近的東南亞地區(qū)和南美的分布模式(圖1)。對于這種分布模式的成因,目前還不清楚,但分布模式在一定程度上反映的是進化歷史,而分類系統(tǒng)是對進化歷史的一種科學(xué)認知方式。遺憾的是啄木鳥的分類系統(tǒng)爭議不斷,如Nesoctites早期被認為屬姬啄木亞科,現(xiàn)在被劃分到啄木鳥亞科,且Hemicircus屬和Nesoctites屬彼此的關(guān)系以及與啄木鳥亞科其他物種的關(guān)系目前還不清楚。此外,早期分類學(xué)研究認為形態(tài)性狀的相似性反映了進化關(guān)系的遠近,研究方法也多采用形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、行為學(xué)、發(fā)聲方式等方法[8-10]。但研究發(fā)現(xiàn),在啄木鳥群體中存在趨同進化、平行進化和擬態(tài)等由環(huán)境因素引起的外形相似現(xiàn)象[11],這導(dǎo)致啄木鳥形態(tài)上的相似性不能代表其進化關(guān)系,使形態(tài)分類的可靠性大打折扣。事實上屬于不同支系而具有相似外形的狀況在啄木鳥中時常發(fā)現(xiàn),例如Dinopium屬和Chrysocolaptes屬。Dinopium屬和Chrysocolaptes屬啄木鳥羽毛圖案非常相似,但研究發(fā)現(xiàn)造成這種相似性的原因是趨同進化,而非共同的血統(tǒng)[6]。近年來,分子方法被大量用于啄木鳥分類研究,從而解決了許多問題。但針對部分啄木鳥,不同研究得到的結(jié)果各不相同,甚至互有矛盾,至今啄木鳥的分類還存在爭議。模糊不清的分類系統(tǒng)意味著對進化歷史的不同理解,由此推測出各不相同的啄木鳥拓殖歷史。啄木鳥的遷移拓殖歷史是其地理分布格局的形成過程,因此對啄木鳥分布格局的解釋也是各不相同。啄木鳥在舊大陸分布117種,新大陸分布138種,并且在新舊大陸上成對地分布著啄木鳥的一些姐妹群體(sister taxon),即在同一進化樹中親緣關(guān)系最近的兩個特定類群[12]。特別是Picumnus屬、Dryobates屬和Picoides屬,在同一屬內(nèi)既包含新大陸物種,又存在舊大陸物種,且Picumnus屬新舊大陸物種分離時間比后兩屬分離要早很多。這些特殊的群體能為研究啄木鳥的遷移拓殖歷史提供證據(jù),通過其拓殖歷史可以推測啄木鳥分布格局的成因。

圖1 啄木鳥科物種的世界分布熱點Fig.1 The distribution hot spot of Picidae物種分布數(shù)據(jù)來源于國際鳥盟網(wǎng)站,使用R軟件中的SP、rgdal、ggplot2以及maptools包繪制分布圖;SN：物種數(shù) species number

啄木鳥群體龐大,對整個群體進行研究相對困難,但經(jīng)過多年的遺傳數(shù)據(jù)累積,在GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)現(xiàn)已有大量的啄木鳥基因數(shù)據(jù),因此大數(shù)據(jù)或許會成為解決啄木鳥分類問題的重要助力?；诖?我們希望通過從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取啄木鳥科各物種基因序列數(shù)據(jù)進行其科內(nèi)物種進化關(guān)系研究。由于一些啄木鳥數(shù)量稀少而導(dǎo)致數(shù)據(jù)缺失如Hylatomusgaleatus和Picoidesramsayi在IUCN的瀕危等級均為易危,全球數(shù)量較少,在數(shù)據(jù)庫內(nèi)缺乏數(shù)據(jù)。此外,在挑選時因數(shù)據(jù)質(zhì)量而舍棄一些數(shù)據(jù),如Campephilusprincipalis最長ND2序列片段為158bp因太短而剔除。最終,本研究共獲取179種啄木鳥可用ND2基因序列數(shù)據(jù),覆蓋近70%啄木鳥科物種,以此對啄木鳥科的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進行研究。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

由于啄木鳥的分類系統(tǒng)此前曾有多次修改,在數(shù)據(jù)庫中命名也存在差異,本次研究采取鳥盟(BirdLife International)使用的分類系統(tǒng)進行檢索[1]。在搜索序列數(shù)據(jù)時,需要逐條核對序列是否為目標(biāo)物種的基因序列,若存在分類信息不明確或是來源不明確的情況則棄之[13]。在數(shù)據(jù)庫內(nèi)許多物種的同一基因存在多條序列數(shù)據(jù),但針對啄木鳥科,由于進行種間分子進化樹的構(gòu)建,種內(nèi)序列差異較小,因此每個物種選取一個樣本進行分析。而在進行新舊大陸同屬姐妹群體的分子進化樹重建時,則選取盡量多的數(shù)據(jù)排除個體差異。基因序列選取的原則包括：1.人工選擇基因序列完整度高的序列；2.軟件對比,選擇同源性更好的序列以保證其可比性。

由于GenBank庫中尚未包含所有啄木鳥的DNA序列,部分?jǐn)?shù)據(jù)也存在諸如序列片段太短、無法確定來源等問題,本研究最終從數(shù)據(jù)庫獲得啄木鳥科 179 個物種線粒體 ND2 基因序列共 183 條。其中包括179個物種各 1條,為了探討新舊大陸同屬姐妹群體系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,針對Picumnus屬內(nèi)唯一的舊大陸種P.innominatus又額外多獲取 4 條該物種的ND2基因序列用于本屬內(nèi)分子進化研究,詳細信息見表S1。

對另外兩個包含新舊大陸姐妹群的屬,即Dryobates屬和Picoides屬,由于選擇盡量多的數(shù)據(jù)以排除個體的差異干擾,但數(shù)據(jù)庫內(nèi),此兩屬ND2基因序列數(shù)據(jù)有限,因此選擇使用數(shù)量相對更多的cytb基因序列。對Dryobates屬中D.scalaris、D.nutttallii、D.pubescens、D.cathpharius以及D.minor5個物種共獲取12條cytb基因序列。Picoides屬的P.canicapillus、P.moluccensis、P.maculatus、P.kizuki、P.arcticus以及P.tridactylus6個物種共獲取9條cytb基因序列。詳細信息見表S2。

響蜜鴷科(Indicatoridae)與啄木鳥科成姐妹群,因此從GenBank庫中獲取黑喉響蜜鴷(Indicatorindicator)和小響蜜鴷(Indicatorminor)ND2基因序列各1條[14],用于構(gòu)建啄木鳥科進化樹時的外群序列。獲取紅胸蟻鴷(Jynxruficollis)cytb基因序列1條用作構(gòu)建Dryobates和Picoides兩屬進化樹時的外群序列。

目標(biāo)序列使用Bioedit7.2.5軟件默認參數(shù)進行對齊,以備后續(xù)分析。

1.2 分子進化樹重建

使用jmodeltest2.1.10軟件對序列進行最佳堿基替換模型選擇,通過赤池信息準(zhǔn)則(Akaike Information Criterion,AIC)選取最佳模型為GTR+I+G(AIC= 176657.1846)。使用MEGA7.0[15]軟件分別用NJ(neighbour joining)法、MP (maximum parsimony)法以及ML(maximum likelihood)法對啄木鳥科179個物種進行進化樹重建。進化樹節(jié)點穩(wěn)健性通過自舉檢驗(bootstrap)評估[16]。針對NJ法和MP法采用1000次自舉檢驗,ML法采用100次自舉檢驗[17]。用NJ法進行對Picumnus屬21個物種、Dryobates屬5個物種和Picoides屬6個物種分別進行進化樹構(gòu)建時,同樣采用1000次自舉檢驗。

2 結(jié)果

2.1 啄木鳥科179種啄木鳥的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

對啄木鳥科179個物種用ND2基因序列構(gòu)建的NJ樹、ML樹和MP樹都將三個亞科識別出來,各亞科內(nèi)包含的屬也相同,但在亞科內(nèi)各分支之間的親緣關(guān)系上三種樹的結(jié)果存在差異。

對于姬啄木鳥亞科,三種算法得出的結(jié)果有所不同,MP樹顯示Verreauxia和Sasia構(gòu)成一支,并且與Picumnus屬以及啄木鳥亞科為同時分離。ML樹顯示Picumnus屬與啄木鳥亞科構(gòu)成姐妹群,又一起與Verreauxia和Sasia的支系構(gòu)成姐妹群。在Picumnus屬內(nèi),唯一的舊大陸種P.innominatus最先分離出來,與屬內(nèi)其他啄木鳥形成姐妹群,此后又分離出P.nebulosus,Picumnus屬剩下的啄木鳥構(gòu)成一個單系群(monophyly group),內(nèi)部分成兩個支系彼此構(gòu)成姐妹群(圖2)。

關(guān)于啄木鳥亞科,除NJ樹顯示其為并系群(paraphyletic group)外,ML樹與MP樹都顯示啄木鳥亞科是單系群。啄木鳥亞科內(nèi)首先分離出來的是Melanerpini族,與其他啄木鳥形成姐妹群,緊接著,Hemicircus屬和Nesoctites屬構(gòu)成一支,分離出來；Campephilini族分離出來,余下的啄木鳥組成Picini族。值得指出的是在我們的結(jié)果中Hemicircus屬和Nesoctites屬形成姐妹群結(jié)構(gòu),Geocolaptesolivaceus則插入了Campethera屬的支系中形成巢式的結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.2 Picumnus屬、Dryobates屬和Picoides屬系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

Picumnus屬內(nèi)21個物種的NJ樹結(jié)果顯示,P.innominatus的五個樣本與本屬其他種構(gòu)成姐妹群,其中DQ479155與DQ188173組成一支,與其他三個樣本構(gòu)成姐妹群。該屬內(nèi)新大陸物種中,P.nebulosus最先分離出來,余下的物種則分成兩個支系(圖3)。

Dryobates屬5個物種cytb基因NJ樹顯示,D.minor與D.cathpharius為姐妹種,一起與其他三種構(gòu)成姐妹群,D.scalaris與D.nuttallii為姐妹種,并且一起與D.pubescens形成姐妹群(圖4)。

Picoides屬6個物種cytb基因序列NJ樹顯示,P.tridactylus與P.arcticus為姐妹種,一起與其他四種構(gòu)成姐妹群,四種啄木鳥的分離順序依次為P.kizuki、P.maculatus、P.moluccensis和P.canicapillus(圖5)。

3 結(jié)論

此前,Winkler等(2014)利用ML法和貝葉斯推論對舊大陸啄木鳥進行系統(tǒng)發(fā)育研究,他們的結(jié)果被廣泛接受,成為啄木鳥現(xiàn)行分類系統(tǒng)的基礎(chǔ)[6]。遺憾的是他們只對舊大陸的啄木鳥進行了研究。后來有人通過超級矩陣使用了25個基因位點對179種啄木鳥進行系統(tǒng)發(fā)育分析,研究比較系統(tǒng)地對啄木鳥群體的關(guān)系進行了探討,但這項研究從GenBank收集的數(shù)據(jù)截止于2014年7月[13]。一來數(shù)據(jù)陳舊,二來,其數(shù)據(jù)缺失嚴(yán)重[12]。最近的研究利用ML法和貝葉斯推論對啄木鳥科進行進化樹構(gòu)建,此研究采用6個基因位點涉及203種啄木鳥[12]。但此研究采用的基礎(chǔ)分類系統(tǒng)中共包含217種啄木鳥,但目前認為啄木鳥現(xiàn)生為254種,因此這個系統(tǒng)是有缺失的[18,19]。三項研究的結(jié)果很大程度上是相同的,在部分物種的關(guān)系上結(jié)果不同,這些差異與他們采用的基礎(chǔ)分類系統(tǒng)和使用的基因位點有關(guān)。結(jié)合三者的研究成果,如啄木鳥亞科應(yīng)為單系群,Hemicircus屬和Nesoctites屬分別與啄木鳥亞科多有報道的姐妹關(guān)系,對比三種樹的自舉檢驗支持度,我們認為ML樹的拓撲結(jié)構(gòu)更為合理(圖2)[6,12-13]。研究結(jié)果支持了大量已有的啄木鳥分類研究成果[6,12,20-21],同時也發(fā)現(xiàn)了一些新的問題。

圖2 啄木鳥科內(nèi)179種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.2 The phylogenetic relationships of 179 woodpeckers基于ND2基因序列,使用最大似然法構(gòu)建,分歧處的數(shù)字為bootstrap重復(fù)百分比

圖3 Picumnus屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其地理分布Fig.3 The phylogenetic relationships and geographical distributions of Picumnu generaa 基于ND2基因序列,使用NJ法構(gòu)建,5個登錄號代表來自P.innominatus不同個體的基因序列；b 物種分布數(shù)據(jù)來源于國際鳥盟網(wǎng)站

圖4 Dryobates屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其地理分布Fig.4 The phylogenetic relationships and geographical distributions of Dryobates generaa 基于cytb基因序列,使用NJ法構(gòu)建；b 物種分布數(shù)據(jù)來源于國際鳥盟網(wǎng)站

圖5 Picoides屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其地理分布Fig.5 The phylogenetic relationships and geographical distributions of Picoides generaa 基于cytb基因,使用NJ法構(gòu)建；b 物種分布數(shù)據(jù)來源于國際鳥盟網(wǎng)站

3.1 啄木鳥科179種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

此外,在Picumnus屬中,P.innominatus作為一種古老的啄木鳥,其分化時間大約在1300萬年之前[12],譚耀匡等根據(jù)形態(tài)學(xué)差異(主要是羽毛顏色圖案)將P.innominatus分為5個亞種[22]。P.innominatus廣泛分布于亞洲南部的喜馬拉雅山脈地區(qū),山脈的隔離作用和漫長的進化時間為多樣化提供了條件。因此,利用5個P.innominatus個體ND2序列與本屬其他物種ND2序列進行屬內(nèi)分子進化樹的重建。發(fā)現(xiàn)與同屬各物種相比,5個同種個體間遺傳差異并沒有被掩蓋(圖3)。這意味著一直以來,P.innominatus種內(nèi)遺傳差異確實被低估了。

相對前兩亞科,啄木鳥亞科的情況更為復(fù)雜。結(jié)果顯示啄木鳥亞科為單系群,雖然bootstrap支持度低,但此前曾有人利用貝葉斯法得出相同的結(jié)果[12,13]?？傮w上,亞科內(nèi)各族形成一個支系,親緣關(guān)系基本與我們采用的分類系統(tǒng)吻合,但有兩點與傳統(tǒng)認識有所不同。

首先Hemicircus屬和Nesoctites屬的系統(tǒng)發(fā)生地位還需要進一步探討。在過去相當(dāng)長一段時間內(nèi),Nesoctites一直被認為是姬啄木亞科的一個屬。Goodge發(fā)現(xiàn)Nesoctitesmicromegas雖然與姬啄木亞科的其他物種非常相似,但它與啄木鳥亞科的物種也共享許多特征[8]；Winkler 和Christie認為其與姬啄木亞科其他物種關(guān)系較遠,建議將其提升為姬啄木亞科的一個族[23]；Benz和Winkler都認為Nesoctites與啄木鳥亞科為姐妹群,建議將其獨立為一個亞科,但他們都沒有討論Hemicircus屬的地位[6,20]。此后又有研究認為Hemicircus屬與啄木鳥亞科構(gòu)成姐妹群[24]。三種方法構(gòu)建的樹所得結(jié)果并不一致,ML樹顯示這兩個屬互為姐妹群,雖然自舉檢驗的支持度不高,但此前曾有過研究得出過相同的結(jié)論[12,13]。Hemicircus屬、Hemicircus屬與啄木鳥亞科彼此之間顯現(xiàn)出與譜系分析結(jié)果不相稱的形態(tài)學(xué)差異,且三者的關(guān)系不甚清楚,這可能由于三者之間的關(guān)系很近而導(dǎo)致算法不能正確識別[13]。Hemicircus屬和Hemicircus屬,其分布地距離遙遠,兩屬物種形態(tài)差異巨大,但考慮到趨同進化和適應(yīng)性進化在啄木鳥亞科物種中時有發(fā)現(xiàn),這或許是對不同分布地環(huán)境適應(yīng)性進化的結(jié)果。

此外,Geocolaptesolivaceus的系統(tǒng)發(fā)生地位也與傳統(tǒng)認識有所不同。Geocolaptesolivaceus與Campethera屬的姐妹關(guān)系曾多有報道[20,25-27],但值得注意的是,在這些報道中多以一個物種代表Campethera屬進行分析。此前曾有研究顯示出不同的結(jié)果,但沒有得到科學(xué)家的關(guān)注[12,13]。而在本結(jié)果中,Geocolaptesolivaceus插入了Campethera屬的支系中(圖2),這與傳統(tǒng)認為的姐妹群關(guān)系并不相符。雖然數(shù)據(jù)量有限,但結(jié)果也否定了Geocolaptesolivaceus與Campethera屬的姐妹關(guān)系。Geocolaptesolivaceus與Campethera屬物種共同分布于非洲南部,但在形態(tài)特征與習(xí)性上差異巨大。Geocolaptesolivaceus體棕褐色,腹部紅色,是少數(shù)營地巢的啄木鳥之一,好貧瘠有巨石的山坡,食物主要是螞蟻及其幼蟲,以及昆蟲的蛹和卵。它們從死樹或者巖石縫隙里尋找食物,也會在地上覓食[7]。Campethera屬共13種啄木鳥,體為綠色,頭紅色,營樹巢,鑿樹取食[7]。推測這種形態(tài)和行為上的巨大差異因為同域分布的強烈競爭而產(chǎn)生,實際上,它們在系統(tǒng)發(fā)育上的差異并沒有表型表現(xiàn)的這么大。

3.2 地理分布

在結(jié)果中能觀察到姐妹群分別分布于新大陸和舊大陸的分布模式,根據(jù)分離時間可將其分為兩組(圖2)。第一組包括四對分別是(1)Picumnus屬同一屬內(nèi)包含新舊大陸姐妹群體；(2)(Dryocopus,Mulleripicus)兩屬構(gòu)成的支系和(Celeus,Piculus,Colaptes)構(gòu)成的支系；(3)Chrysocolaptes屬和Campephilus屬；(4)Nesoctites屬和Hemicircus屬。第二組包括2對,(1)Dryobates屬和(2)Picoides屬,兩屬屬內(nèi)分別包含新舊大陸姐妹群體。不同的是,之前有研究認為Dryocopus屬和Leiopicus屬也在此列[12],但根據(jù)國際鳥盟公布的啄木鳥分布數(shù)據(jù),其分布地并未跨越新舊大陸。第一組姐妹群體新舊大陸物種隔離時間比第二組更早(圖2),其遷移時間大約在1000萬年前,而第二類在大概在500至700萬年前[12]。

從系統(tǒng)發(fā)生來看,舊大陸物種相對新大陸物種更為古老,說明舊大陸物種曾向新大陸遷移,遷移途徑很可能是白令海峽(圖4,圖5)。由于啄木鳥個體遷徙能力并不強,除Picoidestridactylus的分布地橫跨亞歐以及北美之外,其他啄木鳥不存在跨板塊分布。啄木鳥群體這種跨越板塊的復(fù)雜格局顯然是經(jīng)歷多次復(fù)雜的區(qū)域擴張和縮小事件,而這很可能發(fā)生在第四紀(jì)冰川期[12]。第一類啄木鳥群體在第四紀(jì)冰川前由歐亞大陸遷入北美,并且向南擴張占領(lǐng)了南部地區(qū)。第二類啄木鳥遷入新大陸后主要分布于北部,在當(dāng)時由于氣候更為溫暖潮濕,北部的分布范圍比現(xiàn)在更廣。冰川期到來之后,啄木鳥分布分范圍由高緯度地區(qū)向低緯度地區(qū)退縮,新舊大陸完全隔離。在第四紀(jì)冰期與間冰期的循環(huán)中,啄木鳥的分布范圍跟隨冰川范圍發(fā)生變化,冰期范圍縮小,間冰期范圍擴張[28]。一般認為物種形成需要三個步驟即:區(qū)域擴張,領(lǐng)域分割和生殖隔離,這三個步驟循環(huán)進行,從而物種得以形成[29]。在第四紀(jì)冰川期,這種分布上的擴張和退縮在溫帶地區(qū)循環(huán)發(fā)生,因此,在成種能力方面,熱帶地區(qū)低于溫帶地區(qū),但熱帶地區(qū)積累物種的有效時間是大于溫帶的。由于分離時間相對更短一些,第二類物種的分化程度不如第一類明顯。此外,隨著第四紀(jì)的到來,氣候由第三紀(jì)時的溫暖潮濕到更加寒冷而干燥,全球的森林覆蓋范圍萎縮,而草地面積擴張[30-32],啄木鳥隨森林覆蓋范圍的變動而遷移[33]。

因此,啄木鳥呈現(xiàn)分布熱點位于赤道附近的東南亞地區(qū)和南美的分布模式的原因,除了熱帶地區(qū)豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)外,也與物種累積時間有關(guān)。此外,由于啄木鳥的特性,森林覆蓋是影響啄木鳥分布的重要因素,這也是同屬熱帶地區(qū),非洲大陸啄木鳥種類低于南美和東南亞的一個原因。

致謝：東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院周瑜博士對本研究給予幫助，特此致謝。