楊杰 李蘭 戴莉 張江國(guó) 莫善明 徐新龍

摘要?[目的]通過(guò)將特定轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法引物和探針序列重組拼接，并將重組序列連接至質(zhì)粒中，驗(yàn)證其作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照的可行性。[方法]通過(guò)搭橋PCR和全基因合成的方法制備陽(yáng)性重組序列，驗(yàn)證陽(yáng)性重組序列作為陽(yáng)性對(duì)照品的可行性與陽(yáng)性重組質(zhì)粒的均一性、穩(wěn)定性。[結(jié)果]通過(guò)將引物探針序列順序拼接構(gòu)建得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒的性狀均一，在4和-20℃條件下均能穩(wěn)定產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。[結(jié)論]該種陽(yáng)性重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法能夠滿足轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法中陽(yáng)性對(duì)照品的要求。

關(guān)鍵詞?引物;探針序列;轉(zhuǎn)基因檢測(cè);搭橋PCR;陽(yáng)性重組質(zhì)粒

中圖分類號(hào)?Q?943.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0213-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.062

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Construction of Transgenic Potato Detection Positive Recombinant Plasmid by Primer Probe Sequence and Its Validation

YANG Jie，LI Lan，DAI Li et al

（Technical Center of Alashankou Customs，Alashankou，Xinjiang 833418）

Abstract?[Objective]The primers and probe sequences of specific GMO detection method were recombined and spliced， and the recombinant sequences were linked to the plasmid.To verify its feasibility as a positive control for GMO detection.[Method]Positive recombinant sequences were prepared by overlap PCR and whole gene synthesis to verify the feasibility of using positive recombinant sequences as positive reference materials and the homogeneity and stability of positive recombinant plasmid.[Result]The positive recombinant plasmids constructed by sequential splicing of primer probe sequences were uniform in character and could produce stable positive results at 4 ℃ and -20 ℃.[Conclusion]The construction method of the positive recombinant plasmid can meet the requirements of the positive control in the detection of GMO.

Key words?Primer;Probe sequence;GMO detection;Overlap PCR;Positive recombinant plasmid

隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，基因檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全等各個(gè)領(lǐng)域。但由于PCR檢測(cè)過(guò)程中對(duì)檢測(cè)目標(biāo)的不能直觀可見，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，在檢測(cè)環(huán)節(jié)中陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照組的設(shè)立直接關(guān)系到檢測(cè)的判定。對(duì)一個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性對(duì)照物的獲得往往是一個(gè)檢測(cè)工作能否順利開展的關(guān)鍵因素。

在一個(gè)定性PCR檢測(cè)工作中，一般采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照組。用作PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)根據(jù)來(lái)源一般可分為3類[1]：第1類是基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通常是以含有目標(biāo)檢測(cè)物的植物組織或植物產(chǎn)品經(jīng)粉碎加工制成的粉末，使用時(shí)一般在檢測(cè)過(guò)程中與測(cè)試樣品一同處理進(jìn)行核酸提取并進(jìn)行PCR檢測(cè);第2類是含有目標(biāo)檢測(cè)物基因組DNA/RNA溶液，使用時(shí)可以作為某檢測(cè)樣品全部?jī)?nèi)外源檢測(cè)片段的陽(yáng)性對(duì)照模板;第3類是含有目標(biāo)檢測(cè)物某個(gè)檢測(cè)片段基因序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，使用時(shí)需要根據(jù)所檢測(cè)的基因片段選擇所需的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子[2]。

根據(jù)Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的原理，檢測(cè)方法的特異性是由其引物探針的序列特征決定的[3]，而引物探針區(qū)域之間的序列對(duì)擴(kuò)增和檢測(cè)結(jié)果并不會(huì)造成明顯影響。據(jù)此，該研究通過(guò)將特定檢測(cè)方法引物探針序列重組拼接合成，即可獲得一段能用作該檢測(cè)方法陽(yáng)性對(duì)照的DNA序列;再通過(guò)搭橋PCR和全基因合成技術(shù)[4]，將具體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中全部被測(cè)基因陽(yáng)性重組序列順序拼接并進(jìn)行連接至克隆載體上復(fù)制克隆，可得到一個(gè)適用于具體檢測(cè)方法中全部檢測(cè)片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，從而形成一套不依靠陽(yáng)性樣品獲得同時(shí)既方便易得又通用可靠的陽(yáng)性質(zhì)粒的制備方法。

1?材料與方法

1.1?陽(yáng)性物質(zhì)

試驗(yàn)使用轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性玉米樣品為2016年由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的糧食轉(zhuǎn)基因檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃（計(jì)劃編號(hào)：ACAS-PT215）中檢出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因玉米粉，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性馬鈴薯樣品為2015年遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局組織的能力驗(yàn)證項(xiàng)目（計(jì)劃編號(hào)PTC-T112）中陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因品系EH92-527-1馬鈴薯淀粉。

1.2?試劑設(shè)備

植物基因組DNA提取試劑盒DP305、2×Taq PCR MasterMix PCR預(yù)混液，天根生物技術(shù)有限公司;高效 DNA 凝膠回收試劑盒，GeneView公司;

D-5瓊脂糖凝膠、LM SIEVE低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠及熒光標(biāo)記探針，寶生物工程（大連）有限公司;LightCycler 480 Probes Master PCR預(yù)混液，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司;序列合成及序列測(cè)定為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。 熒光定量PCR儀為羅氏LightCycler 96。

1.3?NOS終止子基因陽(yáng)性重組序列的搭橋PCR連接及驗(yàn)證?將SNT 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》[5]中NOS終止子基因檢測(cè)引物探針序列拼接為84 bp的陽(yáng)性重組序列（GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAAACGCGATAGAAAACAAAATATAGCG），由于片段過(guò)長(zhǎng)，不易直接合成，拆分為NU片段（GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGAGAT

GGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCA）、ND片段（CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTTTGCGGGACTCTAATCATAAA

AAC）兩段序列進(jìn)行搭橋PCR連接。

將合成好的NU和ND片段稀釋為10-6 μmol/L，以10 μmol/L SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中NOS終止子基因檢測(cè)引物為上下游引物PCR反應(yīng)體系按照20 μL體系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板各1 μL進(jìn)行配制，反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)。配制2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并回收80 bp左右電泳條帶。

將回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后作為模板對(duì)NOS終止子基因進(jìn)行檢測(cè)，以SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中規(guī)定進(jìn)行PCR體系配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4?CaMV35S啟動(dòng)子基因與NOS終止子基因二元陽(yáng)性重組序列的連接及驗(yàn)證?設(shè)計(jì)CaMV35S與NOS連接接頭引物C-N：5′-TGACGCACAATCCCACTATCGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTG-3′，以梯度稀釋為10-6的NU、ND連接產(chǎn)物為模板，以10 μmol/L 接頭引物C-N作為上游引物，SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中NOS終止子基因檢測(cè)下游引物為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系按照20 μL體系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL進(jìn)行配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，35個(gè)循環(huán)。配制2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并回收90 bp左右電泳條帶。

設(shè)計(jì)合成CaMV35S陽(yáng)性重組序列C0：5′-GCTCCTACAAATGCCATCATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGACGCACAATCCCACTATC-3′，以NU、ND拼接后帶接頭產(chǎn)物和C0為模板，以10 μmol/L SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中CaMV35S啟動(dòng)子基因上游引物、NOS終止子基因下游引物為上下游引物進(jìn)行搭橋PCR連接。PCR反應(yīng)體系按照20 μL體系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板各1 μL進(jìn)行配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，35個(gè)循環(huán)。配制2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并回收140 bp左右電泳條帶。

將回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋作為模板對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子基因和NOS終止子基因進(jìn)行檢測(cè)，以SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中規(guī)定進(jìn)行PCR體系配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因引物探針序列重組陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

1.5.1?基因馬鈴薯外源基因陽(yáng)性重組序列的設(shè)計(jì)。

根據(jù)SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中表A.2中實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯成分引物和探針序列，將CaMV35S、FMV35s、NOS、NPTII、CP4 EPSPS、PLRVrep、PVYep、Cry3A、EH92-527-1全部9個(gè)外源基因拼接為完整的陽(yáng)性重組序列。

為區(qū)別檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果中是否發(fā)生陽(yáng)性重組序列的污染，因此在CaMV35S探針序列和下游引物序列間插入一段外源序列5′-TATGAGCCTGGAGCGCA-3′作為標(biāo)記探針LLI，利用以該序列設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行檢測(cè)，可以將陽(yáng)性重組序列與陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品區(qū)分開。序列信息見表1。

1.5.2?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒的正確性驗(yàn)證。將重組序列送交北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因序列合成，并連接至pES載體，轉(zhuǎn)化至受體菌DH5α中進(jìn)行克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

1.5.3?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒的均勻性驗(yàn)證。

將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行搖培，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將提取得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒稀釋到10 ng，分裝為100份的管中，隨機(jī)挑選其中重組質(zhì)粒15份，按照SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》規(guī)定體系和程序?qū)ν庠椿蜻M(jìn)行檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果Ct值的平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是否符合使用要求。

1.5.4?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性驗(yàn)證。

將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置在4、-20 ℃條件下進(jìn)行保存，分別在7、15、30、90 d時(shí)，按照SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》規(guī)定體系和程序?qū)ν庠椿蜻M(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5?重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)基因樣品檢測(cè)效果的驗(yàn)證。

分別提取50 mg含有轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH92-527-1品系成分的淀粉樣品、轉(zhuǎn)基因玉米陽(yáng)性樣品、非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯樣品的基因組DNA各一份，按照SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》規(guī)定體系和程序?qū)ζ鋬?nèi)外源基因進(jìn)行篩查檢測(cè)。使用非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組DNA作為陰性對(duì)照組模板，陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照組模板。同時(shí)對(duì)樣品和對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)記探針的檢測(cè)，檢測(cè)使用SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中CaMV35S上下游引物和標(biāo)記探針LLI，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)。

2?結(jié)果與分析

2.1?NOS終止子基因陽(yáng)性重組序列的搭橋PCR連接?NU、ND片段搭橋PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。回收連接產(chǎn)物進(jìn)行NOS終止子基因檢測(cè)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，搭橋PCR成功將NU、ND片段連接為完整的NOS基因陽(yáng)性重組序列，序列能夠?qū)OS終止子基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。

2.2?二元陽(yáng)性重組序列的連接

NOS終止子基因陽(yáng)性重組序列通過(guò)PCR加C-N接頭后與C0搭橋PCR連接合成CaMV35S啟動(dòng)子-NOS終止子二元陽(yáng)性重組序列，電泳結(jié)果見圖3。

對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子基因檢測(cè)結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，二次搭橋PCR成功將連接得到的NOS陽(yáng)性重組序列與CaMV35S陽(yáng)性重組序列連接產(chǎn)物能夠有效對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。

2.3?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因引物探針序列重組陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司全基因合成試驗(yàn)服務(wù)結(jié)題報(bào)告（報(bào)告編號(hào)：KT17227），試驗(yàn)成功構(gòu)建含有目的基因全序列628 bp的pES質(zhì)粒載體，并成功轉(zhuǎn)化克隆至受體菌DH5α中，插入片段經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序檢驗(yàn)與目標(biāo)序列一致。

經(jīng)檢測(cè)，全部15份陽(yáng)性重組質(zhì)粒均能夠穩(wěn)定呈現(xiàn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果且Cq值穩(wěn)定（表2），陽(yáng)性重組質(zhì)粒在4、-20℃條件下均穩(wěn)定呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果（表3），符合檢測(cè)均勻性和穩(wěn)定性的要求。通過(guò)將重組陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照品對(duì)轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5和表4），EH92-527-1陽(yáng)性樣品內(nèi)源基因、外源NOS終止子、NPTII、EH92-527-1基因呈陽(yáng)性，其余外源基因呈陰性;轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性玉米樣品CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、CP4-EPSPS、Cry3A基因呈陽(yáng)性，其余外源基因呈陰性;陽(yáng)性重組質(zhì)粒外源基因均呈陽(yáng)性，內(nèi)源基因呈陰性，結(jié)果正常;并且標(biāo)記探針LLI檢測(cè)僅陽(yáng)性重組質(zhì)粒結(jié)果呈陽(yáng)性。

3?討論

3.1?通過(guò)引物探針序列重組陽(yáng)性質(zhì)粒的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法已經(jīng)逐漸擴(kuò)展到生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[6]，其高靈敏度、高分辨率、快速便捷、規(guī)范性操作等優(yōu)勢(shì)在對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化需求日漸嚴(yán)格的今天更加凸顯出來(lái)。但由于PCR檢測(cè)過(guò)程中的檢測(cè)目標(biāo)的不能直觀可見，需要對(duì)在全過(guò)程中可能影響檢測(cè)結(jié)果因素逐一進(jìn)行驗(yàn)證排除，因此在各個(gè)檢測(cè)環(huán)節(jié)中合理設(shè)置陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照組直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的可靠性與否。根據(jù)現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過(guò)程中需要設(shè)立陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照、陰性目標(biāo)DNA對(duì)照、PCR抑制對(duì)照、擴(kuò)增試劑對(duì)照、提取空白對(duì)照、陽(yáng)性提取對(duì)照、環(huán)境對(duì)照這七大類對(duì)照組試驗(yàn)。其中陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照、PCR抑制對(duì)照、陽(yáng)性提取對(duì)照3類對(duì)照組均需要使用對(duì)應(yīng)每個(gè)檢測(cè)目標(biāo)基因的陽(yáng)性對(duì)照品來(lái)開展試驗(yàn)?？梢哉f(shuō)如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室想要建立一個(gè)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)能力，陽(yáng)性對(duì)照品的獲得是其能否成功的關(guān)鍵因素。

以往檢測(cè)過(guò)程中所使用的陽(yáng)性物質(zhì)一般為各類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)確認(rèn)鑒定的陽(yáng)性樣品，這些陽(yáng)性樣品能夠滿足不同情況的使用需求。但從實(shí)際工作出發(fā)，檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)需求千變?nèi)f化，受不同時(shí)間空間等因素的影響很大，而各類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得本質(zhì)上都基于陽(yáng)性樣品的獲得。對(duì)于沒有市售途徑、收到貿(mào)易制約、上市時(shí)間久遠(yuǎn)或生物安全風(fēng)險(xiǎn)較高的陽(yáng)性樣品往往難于獲得。在有檢測(cè)需求時(shí)卻不能及時(shí)獲得合適的陽(yáng)性對(duì)照品很有可能會(huì)成為制約一個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)能力發(fā)展的重要因素。

基于水解探針?lè)ǖ膶?shí)時(shí)熒光PCR原理，通過(guò)將具體檢測(cè)方法中所使用的引物探針序列進(jìn)行順序拼接重組而構(gòu)成的陽(yáng)性重組質(zhì)粒能夠以幾十至數(shù)百元的成本，在十幾天的周期內(nèi)就獲得任一檢測(cè)方法所需要的陽(yáng)性物質(zhì)。且這種陽(yáng)性物質(zhì)具有高度的方法專一性，對(duì)于不同檢測(cè)方法間不會(huì)產(chǎn)生污染，并且能夠通過(guò)序列設(shè)計(jì)在每種陽(yáng)性質(zhì)粒中插入獨(dú)立標(biāo)記序列，實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的可識(shí)別可追溯。此外，通過(guò)對(duì)特定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法建立對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性質(zhì)粒，可以有效幫助標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)施，促進(jìn)檢測(cè)工作標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)行。

3.2?存在的問(wèn)題及改進(jìn)方向

首先，實(shí)際工作應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行重組序列的構(gòu)造設(shè)計(jì)，每一個(gè)陽(yáng)性序列可以按照上游引物序列、探針序列、下游引物反向互補(bǔ)序列的順序拼接在一起。當(dāng)需要設(shè)計(jì)多個(gè)序列時(shí)可以直接拼接，還可以對(duì)不同重組序列片段進(jìn)行比較，將序列末端相同的若干基因序列進(jìn)行壓縮堿基拼接，以達(dá)到減小片段長(zhǎng)度的目的。

其次，在序列合成時(shí)，可以根據(jù)檢測(cè)的需求，對(duì)于陽(yáng)性序列的獲得采用不同的方式：對(duì)于70 bp以下可以考慮直接化學(xué)合成，對(duì)于70～200 bp可以考慮通過(guò)搭橋PCR的方式多次拼接，對(duì)于200 bp以上的多元陽(yáng)性重組可以采用全基因合成的方式。但由于100 bp以下的oligoDNA片段在試驗(yàn)操作中較容易產(chǎn)生氣溶膠，對(duì)于試驗(yàn)空間、試驗(yàn)條件、試驗(yàn)操作較為有限的實(shí)驗(yàn)室會(huì)有較大的風(fēng)險(xiǎn)形成陽(yáng)性氣溶膠污染[9]，通過(guò)將陽(yáng)性序列分解為不具備完整擴(kuò)增產(chǎn)物的片段進(jìn)行搭橋PCR連接能夠更好地避免污染。如果出于操作流程和防污染的角度出發(fā)，將5～12個(gè)陽(yáng)性重組序列進(jìn)行拼接構(gòu)建一個(gè)長(zhǎng)片段進(jìn)行全基因合成能夠更加方便快捷，成本也更低。

第三，在3類陽(yáng)性對(duì)照組中，陽(yáng)性對(duì)照的主要功能是確保擴(kuò)增體系溶液配制正確，溶液中不含抑制擴(kuò)增反應(yīng)的成分，重組陽(yáng)性質(zhì)粒能完全勝任陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照、PCR抑制對(duì)照組的功能。但是陽(yáng)性提取對(duì)照僅能使用陽(yáng)性樣品或陽(yáng)性基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照品。設(shè)立陽(yáng)性提取對(duì)照的目的是確保在DNA提取過(guò)程中保障模板DNA提取的質(zhì)量，確保被測(cè)目標(biāo)基因序列不因提取方法的不當(dāng)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。但一般的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中都會(huì)加入內(nèi)源基因的檢測(cè)組，通過(guò)內(nèi)源基因Ct值的大小限制確保樣品DNA模板提取的濃度滿足檢測(cè)需求，這在很大程度上就足以代替陽(yáng)性提取對(duì)照組的功能。

第四，由于引物探針序列重組陽(yáng)性質(zhì)粒本身并不是目標(biāo)擴(kuò)增的全長(zhǎng)片段，通常情況下會(huì)略短于全長(zhǎng)片段，因此與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比可能存在影響擴(kuò)增效率的潛在因素。但出于常規(guī)實(shí)時(shí)熒光PCR引物探針設(shè)計(jì)原則[10]，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與引物探針區(qū)間序列不應(yīng)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因此重組序列應(yīng)當(dāng)能滿足大多數(shù)定性檢測(cè)方法的需求。

第五，對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR而言，重組質(zhì)粒與目標(biāo)擴(kuò)增的全長(zhǎng)片段在擴(kuò)增效率上的影響需要更進(jìn)一步的定量分析，未經(jīng)驗(yàn)證的重組質(zhì)?？赡懿粦?yīng)直接用于定量檢測(cè)結(jié)果的分析，以避免重組序列構(gòu)建對(duì)定量結(jié)果的不確定性影響。

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